多糖类物质的研究进展
李自明 11级食品科学与工程 111304023
摘要 多糖是由10个以上单糖通过糖苷键连接而成的聚糖，在自然界中分布极广，在高等植物、藻类、菌类及动物体内均有存在，是自然界含量最丰富的生物聚合物。人们对多糖的认识首先是把它看作食物中的能量来源。多糖作为药物始于1943年，但从20世纪60年代以来，人们逐渐发现多糖在抗肿瘤、肝炎、心血管疾病、衰老等方面有独特的生物活性，且细胞毒性极低。近年来，由于天然药物化学、药理学研究的不断深入，多糖分析手段得到突飞猛进的发展。研究发现，多糖可作为生命活动中核心作用的遗传物质，它能控制细胞分裂和分化，调节细胞的生长与衰老等多种复杂的功能。本文将对多糖的提取、分离纯化、组分分析以及生物活性等研究内容做一综述。
关键词 多糖; 分离纯化; 结构分析; 生物活性
1多糖的研究概况
多糖是除了蛋白质和核酸以外的一类重要的生物大分子, 虽然糖类的研究并不比蛋白质和核酸晚, 但其研究层次与水平还远远落后于蛋白质和核酸。20世纪 70年代以来, 随着免疫物质、 生物膜及多种生物活性物质的研究表明, 糖类在生物体内具有各种关键的生物学功能, 因此糖类的研究成为人们关注的焦点。大量的药理实验表明, 多糖类化合物具有免疫增强与调节、 抗肿瘤、 抗病毒、 抗凝血、 抗放射、 抗衰老等作用。日本自20世纪80年代以来, 已有数种多糖应用于临床。近年来, 日本及欧美学者引进现代分子生物学技术手段, 加强对中药多糖活性决定簇等化学结构与功能关系的研究, 并在柴胡、 当归等中药的研究方面有了一定的突破。国内的研究起步较晚, 虽然已在云芝糖肽、 银耳多糖等的研究中取得了一定的进展, 但对药用多糖的研究仍多偏重于提取、 分离、 精制、 化学组成等方面, 大多数品种尚处于实验阶段或仅用于滋补品和饮料, 与国外相比仍有一定的差距。
2多糖的分离纯化与性质研究
2.1 多糖的提取分离与纯化
多糖是极性大分子化合物，大多采用不同温度的水、稀碱或稀盐溶液提取，尽量避免在酸性条件下提取，以防引起糖苷键的断裂。稀酸提取时，时间宜短，温度不宜超过50℃。由于水提时间长且效率低，酸碱提取易破坏多糖的立体结构及活性。现有采用复合酶热水浸提相结合的方法提取多糖，复合酶多采用一定比例的果胶酶、纤维素酶及中性蛋白酶。此法具有条件温和、杂质易除和得率高的优点。
多糖提取之后，其中还含有许多杂质要除去。一般首先利用多糖难溶于有机溶剂的特性，用乙醇或丙酮进行反复沉淀洗涤，除去一部分醇溶性杂质，然后用Sevag 等法脱游离蛋白质。用蛋白酶去除结合蛋白质，小分子杂质的除去可以用透析法。
至此，得到的溶液基本上是没有蛋白质与小分子杂质的多糖混合物。
分级（即将多糖混合物分离为单一的多糖）的方法很多，主要有以下一些方法：分部沉淀法、盐析法、金属络合法、季铵盐沉淀法、纤维柱层析法、纤维素阴离子交换柱层析法、凝胶柱层析法、超滤法、制备性区域电泳法和制备性高压液相色谱法等，但大多数采用DEAE 纤维素、DEAE 、凝胶及其它凝胶柱层析法进行纯化，国外常采用LKB 柱层析系统。
2.2 多糖纯度的鉴定
多糖的纯度不能用通常化合物的纯度标准来衡量，因为即使是多糖纯品，其微观也是不均一的。多糖的纯度只代表相似链长的平均分布。我们通常所说的多糖纯品实质上是一定分子量范围的均一组分。目前各国常用的纯度鉴定方法有：超离心、高压电泳、凝胶层析和旋光测定。现在应用较多的是HPLC 法。通常要肯定某一多糖的均一性，必须要有两种方法以上的鉴定结果。
2.3 多糖分子量的测定
多糖的分子量测定至今仍是一个复杂的问题。现在还没有一种准确的测定方法。多糖的分子量只代表一定相似链长的平均配布。往往用不同的方法会测得不同的分子量，即使是同一多糖其重均分子量也会与数均分子量相差很大。目前常用的测定分子量的方法很多，如渗透法、超离心法、超过滤法、高压电泳法、粘度法、光散射法、还原末端法及聚合度法等，这些方法比较麻烦且误差较大。耐压合成凝胶的出现使得高效液相色谱法广泛应用于多糖的纯度和分子量的测定。它具有快速、高分辨率和重现性好等优点。而在实验室中最常用的方法是凝胶过滤法。
3 多糖的生物活性
3.1 对免疫系统作用
3.1.1 多糖对巨噬细胞功能的影响
在机体的免疫系统中，巨噬细胞由于其活跃的生物学功能尤其是在免疫应答和机体防御机制中的重要作用而一直受到重视。巨噬细胞能表达数十种受体，产生数十种酶，并能分泌近百种生物活性产物，是体内功能最为活跃的细胞之一。巨噬细胞具有吞噬功能，能主动吞噬和清除颗粒性外来抗原或直接杀伤病原微生物；还能通过其产生的肿瘤坏死因子(TNFα) 及NO 等分子杀伤靶细胞，同时产生多种生物活性物质，发挥其免疫调节作用。Ramesh H 等[3]研究了胡芦巴半乳糖配甘露聚糖对大鼠腹腔巨噬细胞的吞噬活性、人淋巴细胞HB4C5增殖和免疫球蛋白M 分泌的活化作用。多糖碱提取部分B 在10μg/ml 浓度下对大鼠腹腔巨噬细胞表现出40%的活化作用。对于HB4C5淋巴细胞，碱提取的多糖B 能提高其活化百分率，对IgM 分泌的影响在2.5μg/ml浓度下表现为24%的抑制作用。Bianco ID 等从真菌细胞壁中发现的一种壳聚糖，能以剂量、时间依赖方式通过增强花生四烯酸的活性来激活巨噬细胞[4]。现研究发现从Panax quinquefolius L. 根茎中提取的多糖具有刺激肺巨噬细胞分泌TNF
α的作用[5]。
3.1.2 多糖对淋巴细胞功能的影响
淋巴细胞是构成免疫器官的基本单位，在免疫应答过程中起核心作用。淋巴细胞分为T 、B 、NK 、K 、LAK 细胞等[6]。T 细胞在机体的细胞免疫和体液免疫诱导中均有重要作用，作为免疫效应细胞，主要有两方面功能：即作为TDTH 介导迟发型超敏反应和作为T 细胞直接杀伤靶细胞。B 细胞通过其分泌的抗体行使其免疫功能。另外活化的B 细胞还具有加工和提呈抗原给T 细胞的作用。NK 细胞即自然杀伤细胞，它既不需经抗原刺激，也不需要抗体参与，即能杀伤某些靶细胞。同时NK 细胞也是一类重要的免疫调节细胞，它对T 细胞、B 细胞、骨髓干细胞等均有调节作用，并通过释放细胞因子对机体免疫功能进行调节。从多叶奇果菌
C (rifolafrondosa)分离得到的多糖D 一片段，能激活肿瘤患者体内的NK 细胞，使TNF α和干扰素(IFNγ) 水平升高，同时还可通过激活巨噬细胞，使IL 12分泌增加，后者也是NK 细胞的激活剂，可使NK 细胞长期发挥细胞毒作用，抑制肿瘤细胞的生长[1]。Park JI等用热水和碱水从一种韩国药用植物黄柏的皮层中提取、分离纯化得到一种杂多糖，表现出有效的B 淋巴细胞刺激活性[2]。
3.1.3 多糖对抗体生成的影响
抗体与抗原特异结合，可直接中和具有毒性的抗原分子；抗体结合抗原后形成的复合物易被吞噬细胞吞噬清除；抗体又可与抗原结合后，再结合补体，使补体活化，杀伤病原体。Han SB等报道，从Platycodon grandiflorum (PG)根中分离的一种多糖能够显著地增加IgM 的产生，促进B 细胞增殖，刺激巨噬细胞内一氧化氮合酶(iNOS)的转录和产生[7]。Nergard CS等发现Vernonia kotschyana的根茎可以治疗胃炎、十二指肠溃疡，而从其根茎中提取的多糖具有促进B 细胞增殖、激活T 细胞的作用[8]。
3.1.4 多糖对细胞因子分泌的影响
细胞因子是由活化的免疫细胞和某些基质细胞分泌的一类小分子糖蛋白，具有多样生物学作用，包括促进靶细胞增殖分化、增强对感染的抵抗力、参与调节机体的免疫应答和炎症反应、影响细胞代谢等。从Phellinus linteus中提取的PL 多糖，通过产生NO 和TNF α抵抗Yac 1细胞的毒性作用，而起到免疫调节和抗肿瘤作用[9]。Anastase Ravion S等在研究天然硫酸化多糖的免疫调节特性时发现，葡聚糖衍生物和褐海藻能影响LPS ，刺激M φ引起的致炎细胞因子释放[10]。
3.2 多糖的抗肿瘤作用
多糖溶于水是其发挥生物活性的前提。作为药物多糖的研究已给肿瘤的化疗开辟了新的领域。Wang JC 等研究发现，通过调整C/N比例、pH 值、温度，从Pleurotus citrinopileatus 中提取的主要由葡萄糖和甘露糖组成的可溶性多糖SPPC ，可以显著增加肺转移性肿瘤小鼠体内T 细胞、CD4(+)细胞、CD8(+)细胞和巨噬细胞数量, 抑制肿瘤细胞的增殖[11]。从枸杞中提取的多糖蛋白质复合体LBP3p 能作用S180肉瘤小鼠的免疫系统，表现为增强巨噬细胞的吞噬活性，促
进淋巴细胞增生，增强细胞毒性T 细胞活性，增加IL 2 mRNA 的表达，同时减少S180小鼠脂质过氧化[12]。Ji YB等研究发现，S180小鼠与正常小鼠比较，其红细胞膜上带3蛋白含量呈明显下降趋势，而且出现交联蛋白，小鼠红细胞微粘度升高，膜脂流动性下降。而药用和食用仙人掌多糖都可提高荷瘤小鼠红细胞膜带3蛋白的含量，降低交联蛋白的形成，改善膜脂流动性，降低荷瘤小鼠红细胞膜的微粘度，从而部分恢复、提高红细胞膜结构的完整性与生理功能的正常性，增强红细胞免疫功能，这可能是仙人掌多糖抗肿瘤作用的机制之一[13]。从韩国红人参中提取的红人参酸多糖(RGAP)，通过刺激巨噬细胞产生NO 调节免疫和抗肿瘤。研究发现，RGAP 和紫杉醇在小鼠S180肉瘤和B16黑色素瘤的联合治疗中可起协同作用。RGAP 可呈浓度依赖性的刺激脾细胞分泌IL 6，同时拮抗紫杉醇对NK 细胞活性的抑制作用[14]。Liu JJ 等研究发现，从樟脑菌丝中分离纯化的多糖AC PS ，通过激活单核细胞而抑制人白血病U937细胞的增殖，抑制率约达55.3%[15]。
3.3 多糖的抗炎作用
抗炎活性的多糖在国外研究较多的是细菌荚膜多糖，其中脆弱类杆菌(Bacteroides fragilis) 荚膜多糖的抗感染活性研究的较为深入[16]。脆弱类杆菌的荚膜多糖分为两种组分：Ps A和Ps B。这些荚膜多糖居于细菌表面，形成脆弱类杆菌的所谓荚膜多糖复合物(capsular polysaccharide complex,CPC)，具有显著的生物活性。其中Ps A活性较强，在体外具有T 细胞增殖活性[17]，在体内具有抗脓肿形成作用[18]。来源于真菌细胞壁的β
有抗炎作用。服用可溶性β(1～3) 葡聚糖也具(1～3) 葡聚糖，能够显著增加动物体内参与循环的中性粒细胞数量，还可提高单核细胞和中性粒细胞抗微生物的活力，增强巨噬细胞的功能，并刺激骨髓造血[19]。服用PGG 葡聚糖[一种高度纯化的具有β(1～6) 分支的葡聚糖]的动物进行血培养，和对照组相比，可检出较少的微生物数量。一次性注射PGG 葡聚糖的小鼠或大鼠，其白细胞总数出现一过性升高，即使在感染后4 h 服用PGG 葡聚糖也能显著地降低死亡率[20]。来自一种菌丝体的胞外多糖(exopolysaccharides,EPSs)，也具有抗炎活性，腹腔注射能够显著提高小鼠对产单核李斯特菌感染的抵抗力，在体内能够诱导淋巴细胞的增殖
[21]。当发生急性炎症时，炎症因子与抗炎症因子间存在着平衡关系，影响着炎症发生的进程。当机体感染细菌后，多种炎症介质迅速释放，包括TNF α、IL 1、IL 6和IL 8；数小时后，抗炎症因子如IL 10、MCP 1产生，以对抗炎症反应。此外，这些细胞因子能够直接抑制炎症因子的生成或促进特定细胞因子抑制剂的合成，如IL 1受体和可溶性TNF 受体；也可下调趋化因子及其受体和Th1细胞因子的水平。抗炎的机制一般认为是促进免疫细胞的活性，下调炎症因子如TNF α、IL 1、IL 6和IL 8，上调抗炎症因子如IL
10和MCP 1等[22]。Glucuronoxylomannan (GXM) 是Cryptococcus
neoformans 中主要的荚膜多糖，它上调抗炎因子IL 10表达的同时抑制IL 2的表达而达到抗炎作用[23]。
3.4 多糖的抗病毒作用
某些多糖或衍生物对各种病毒有抑制作用，如人免疫缺陷病毒(HIV)、单纯疱疹病毒(HSV)、人巨细胞病毒(HCMV)、流感病毒、囊状胃炎病毒、劳斯肉瘤病毒和鸟肉瘤病毒等[24]，这些多糖大都含有硫酸基。其作用机制除了从整体上调节机体免疫能力外，还可以在两方面产生抗病毒作用：①竞争抑制病毒对靶细胞的粘附和穿透。HIV 1反式激活因子在细胞外攻击靶细胞如CD4(+)和内皮细胞起作用，而大肠埃希氏杆菌多糖的硫酸化衍化物具有与肝素相似结构，但没有抗凝血活性，可以作为HIV 1反式激活因子拮抗剂而起到阻止HIV 病毒对靶细胞的粘附和穿透作用[25，26]。从Prunella vulgaris中提取的多糖具有竞争抑制HSV 1，2的细胞粘附位点而抑制病毒的穿透[27]。②抑制病毒增殖。一些硫酸化的海藻多糖具有抗包膜病毒的能力，疱疹单纯病毒通过包膜表面蛋白C 和靶细胞表面硫酸乙酰肝素结合而进入细胞内，而海藻多糖可抑制此结合。红海藻多糖片断F6不仅能有效的抑制疱疹单纯病毒I 型的复制，而且还可选择性的抑制疱疹单纯病毒II 型、人巨细胞病毒、流感病毒A/B型、塔卡里伯病毒的增殖[28]。
3.5 多糖的抗凝血活性
目前报道具有抗凝血作用的多糖多为来源于海藻的硫酸化多糖。其抗凝机制可能有：① 同抗凝血酶结合，诱导其改变构型，从而将其激活。②对一种血清蛋白酶抑制因子(肝素辅因子Ⅱ) 的激活[29]。肝素是内源性抗凝血物质，属于含硫酸基的糖胺聚糖，带有负电荷，它主要通过增强抗凝血酶(肝素辅助因子II ，HCII) 的作用来抗凝血。从海藻中分离到多种结构的硫酸化岩藻聚糖或硫酸化D 半乳聚糖，它们的抗凝血活性与化学结构、相对分子质量和硫酸基含量有关，它们能提高抗凝血酶因子Ⅲ(ATW)或肝素辅助因子Ⅱ的活性，从而抑制凝血过程所必须的丝氨酸蛋白酶、凝血酶的活性而发挥作用[30]。从人参根中提取的一种酸性多糖，由半乳糖、阿拉伯糖和糖醛酸组成，也具有抗凝血活性[31]。
3.6 多糖的抗衰老作用
一些植物或微生物来源的多糖具有抗衰老活性。一方面这类多糖作为免疫调节剂上调机体的免疫功能；另一方面可以增强机体对自由基的清除能力和抗氧化能力[32]。芦笋多糖为禾本植物芦苇嫩苗的提取物，它可明显拮抗D 半乳糖所致衰老小鼠免疫器官及组织的萎缩，使皮质厚度增加，皮质细胞数增加，脾小节增大及淋巴细胞数增加[33]。
3.7 多糖的降血糖作用
Huang ZX等发现从Spirulina platensis和Sargassum thunbeergii提取的多糖PSP 和PST 按1∶1组成的复合物具有降低四氧嘧啶所致的糖尿病小鼠血清血糖、TC 、TG 、 NO、ET 和增加HDL C 的水平
4 多糖类物质的研究方向
近20年来, 国内外各类多糖物质不断进入临床, 主要集中在抗感染、 抗肿瘤、 抗风湿、 抗消化道溃疡和增进免疫功能等方面。其报道的临床药理和适应
征各有异同, 多糖的基本结构也各有异同, 但大多数研究是基于体内外病理模型的药效学实验, 而缺乏其糖链的基本结构、 体内代谢以及体内相应配体作用机理的研究。因此每种多糖物质的多向药效作用过于笼统, 药理机理与结构基础研究尚在发展。目前多糖物质的进展有两方面:一是根据多糖本身在消化道药理与药代动力学原理, 发展新型的降血脂、 抗脂肪肝、
抗高血糖、 促进免疫功能等的治疗研究。二是依据多糖分子结构为基础而阐明的生物学现象, 合成与模拟体内多糖分子或相应配体, 或比天然多糖分子更有效的衍生物或类似物用于疾病治疗。国外基于先进的基础研究大力发展此类物质, 在抗炎症、 抗肿瘤与抗病毒感染等方面已取得较大进展。
参考文献
1 于淑娟, 高大维, 李国基. 超声波酶法提取灵芝多糖的机理研究[ J ] . 华南理工大学学报, 1998, 26(2) : 123- 127.
2 孙向军, 姚晓敏, 闵锐. 酶法提取螺旋藻粗多糖的研究[ J] .上海农学院学报, 1999, 17(2) : 115- 118.
3 李林, 罗琼, 张声华. 海带多糖的分类提取、 鉴定及理化特性研究[ J] .食品科学, 2000, 21(4) : 28- 32.
4 王转子, 支德娟, 关红梅. 半枝莲多糖和白花蛇舌草多糖抗衰老作用的研究[ J] . 中兽医医药杂志, 1999, 4: 5- 7.
5 王建华, 王汉中, 张 民, 等. 枸杞多糖延缓衰老的作用[ J ] . 营养学报,2002, 24(2) : 189- 194.
6 张拥军, 王兰州, 姚惠源. 南瓜中降血糖活性成分的提取及其功能性质的研究[ J] . 食品与发酵工业, 2002, 28(6) : 32- 35.
7 Ma tsuiM S,Muiz zuddin N,Arad S, et al. Sulfated polysacchari des from red m- ic roal gae have antiinfla mma tory prope rt ie s i n vi tro and i n vivo[ J] . Appl Bioc hemBiot echno l , 2003, 104(1) : 13- 22.
8 Yoon S J,Pereira M S, PavaoM S, et al. The me dici nal plant Porana volubili scontains polysacchari deswit h ant ic oagulant activity mediated by hepari n cofactorII[ J] .Thromb Res, 2002, 106( 1) : 51- 58.
9Mulloy B,Mourao PA,Gray E.Structure/function studies of anticoagulant sulphated polysaccharides using NMR[J].J Biotechnol，2000，77(1):123
10 Farias WR,Valente AP,Pereira Ms，et al.Structure and anticoagulant activity of sulfated galactans.Isolation of a unique sulfated galactan from the red algae Botryocladia occidentalis and comparison of its anticoagulant action with that of sulfated galactans from invertebrates[J].J Biol Chem，2000，275(38):29299
多糖类物质的研究进展
李自明 11级食品科学与工程 111304023
摘要 多糖是由10个以上单糖通过糖苷键连接而成的聚糖，在自然界中分布极广，在高等植物、藻类、菌类及动物体内均有存在，是自然界含量最丰富的生物聚合物。人们对多糖的认识首先是把它看作食物中的能量来源。多糖作为药物始于1943年，但从20世纪60年代以来，人们逐渐发现多糖在抗肿瘤、肝炎、心血管疾病、衰老等方面有独特的生物活性，且细胞毒性极低。近年来，由于天然药物化学、药理学研究的不断深入，多糖分析手段得到突飞猛进的发展。研究发现，多糖可作为生命活动中核心作用的遗传物质，它能控制细胞分裂和分化，调节细胞的生长与衰老等多种复杂的功能。本文将对多糖的提取、分离纯化、组分分析以及生物活性等研究内容做一综述。
关键词 多糖; 分离纯化; 结构分析; 生物活性
1多糖的研究概况
多糖是除了蛋白质和核酸以外的一类重要的生物大分子, 虽然糖类的研究并不比蛋白质和核酸晚, 但其研究层次与水平还远远落后于蛋白质和核酸。20世纪 70年代以来, 随着免疫物质、 生物膜及多种生物活性物质的研究表明, 糖类在生物体内具有各种关键的生物学功能, 因此糖类的研究成为人们关注的焦点。大量的药理实验表明, 多糖类化合物具有免疫增强与调节、 抗肿瘤、 抗病毒、 抗凝血、 抗放射、 抗衰老等作用。日本自20世纪80年代以来, 已有数种多糖应用于临床。近年来, 日本及欧美学者引进现代分子生物学技术手段, 加强对中药多糖活性决定簇等化学结构与功能关系的研究, 并在柴胡、 当归等中药的研究方面有了一定的突破。国内的研究起步较晚, 虽然已在云芝糖肽、 银耳多糖等的研究中取得了一定的进展, 但对药用多糖的研究仍多偏重于提取、 分离、 精制、 化学组成等方面, 大多数品种尚处于实验阶段或仅用于滋补品和饮料, 与国外相比仍有一定的差距。
2多糖的分离纯化与性质研究
2.1 多糖的提取分离与纯化
多糖是极性大分子化合物，大多采用不同温度的水、稀碱或稀盐溶液提取，尽量避免在酸性条件下提取，以防引起糖苷键的断裂。稀酸提取时，时间宜短，温度不宜超过50℃。由于水提时间长且效率低，酸碱提取易破坏多糖的立体结构及活性。现有采用复合酶热水浸提相结合的方法提取多糖，复合酶多采用一定比例的果胶酶、纤维素酶及中性蛋白酶。此法具有条件温和、杂质易除和得率高的优点。
多糖提取之后，其中还含有许多杂质要除去。一般首先利用多糖难溶于有机溶剂的特性，用乙醇或丙酮进行反复沉淀洗涤，除去一部分醇溶性杂质，然后用Sevag 等法脱游离蛋白质。用蛋白酶去除结合蛋白质，小分子杂质的除去可以用透析法。
至此，得到的溶液基本上是没有蛋白质与小分子杂质的多糖混合物。
分级（即将多糖混合物分离为单一的多糖）的方法很多，主要有以下一些方法：分部沉淀法、盐析法、金属络合法、季铵盐沉淀法、纤维柱层析法、纤维素阴离子交换柱层析法、凝胶柱层析法、超滤法、制备性区域电泳法和制备性高压液相色谱法等，但大多数采用DEAE 纤维素、DEAE 、凝胶及其它凝胶柱层析法进行纯化，国外常采用LKB 柱层析系统。
2.2 多糖纯度的鉴定
多糖的纯度不能用通常化合物的纯度标准来衡量，因为即使是多糖纯品，其微观也是不均一的。多糖的纯度只代表相似链长的平均分布。我们通常所说的多糖纯品实质上是一定分子量范围的均一组分。目前各国常用的纯度鉴定方法有：超离心、高压电泳、凝胶层析和旋光测定。现在应用较多的是HPLC 法。通常要肯定某一多糖的均一性，必须要有两种方法以上的鉴定结果。
2.3 多糖分子量的测定
多糖的分子量测定至今仍是一个复杂的问题。现在还没有一种准确的测定方法。多糖的分子量只代表一定相似链长的平均配布。往往用不同的方法会测得不同的分子量，即使是同一多糖其重均分子量也会与数均分子量相差很大。目前常用的测定分子量的方法很多，如渗透法、超离心法、超过滤法、高压电泳法、粘度法、光散射法、还原末端法及聚合度法等，这些方法比较麻烦且误差较大。耐压合成凝胶的出现使得高效液相色谱法广泛应用于多糖的纯度和分子量的测定。它具有快速、高分辨率和重现性好等优点。而在实验室中最常用的方法是凝胶过滤法。
3 多糖的生物活性
3.1 对免疫系统作用
3.1.1 多糖对巨噬细胞功能的影响
在机体的免疫系统中，巨噬细胞由于其活跃的生物学功能尤其是在免疫应答和机体防御机制中的重要作用而一直受到重视。巨噬细胞能表达数十种受体，产生数十种酶，并能分泌近百种生物活性产物，是体内功能最为活跃的细胞之一。巨噬细胞具有吞噬功能，能主动吞噬和清除颗粒性外来抗原或直接杀伤病原微生物；还能通过其产生的肿瘤坏死因子(TNFα) 及NO 等分子杀伤靶细胞，同时产生多种生物活性物质，发挥其免疫调节作用。Ramesh H 等[3]研究了胡芦巴半乳糖配甘露聚糖对大鼠腹腔巨噬细胞的吞噬活性、人淋巴细胞HB4C5增殖和免疫球蛋白M 分泌的活化作用。多糖碱提取部分B 在10μg/ml 浓度下对大鼠腹腔巨噬细胞表现出40%的活化作用。对于HB4C5淋巴细胞，碱提取的多糖B 能提高其活化百分率，对IgM 分泌的影响在2.5μg/ml浓度下表现为24%的抑制作用。Bianco ID 等从真菌细胞壁中发现的一种壳聚糖，能以剂量、时间依赖方式通过增强花生四烯酸的活性来激活巨噬细胞[4]。现研究发现从Panax quinquefolius L. 根茎中提取的多糖具有刺激肺巨噬细胞分泌TNF
α的作用[5]。
3.1.2 多糖对淋巴细胞功能的影响
淋巴细胞是构成免疫器官的基本单位，在免疫应答过程中起核心作用。淋巴细胞分为T 、B 、NK 、K 、LAK 细胞等[6]。T 细胞在机体的细胞免疫和体液免疫诱导中均有重要作用，作为免疫效应细胞，主要有两方面功能：即作为TDTH 介导迟发型超敏反应和作为T 细胞直接杀伤靶细胞。B 细胞通过其分泌的抗体行使其免疫功能。另外活化的B 细胞还具有加工和提呈抗原给T 细胞的作用。NK 细胞即自然杀伤细胞，它既不需经抗原刺激，也不需要抗体参与，即能杀伤某些靶细胞。同时NK 细胞也是一类重要的免疫调节细胞，它对T 细胞、B 细胞、骨髓干细胞等均有调节作用，并通过释放细胞因子对机体免疫功能进行调节。从多叶奇果菌
C (rifolafrondosa)分离得到的多糖D 一片段，能激活肿瘤患者体内的NK 细胞，使TNF α和干扰素(IFNγ) 水平升高，同时还可通过激活巨噬细胞，使IL 12分泌增加，后者也是NK 细胞的激活剂，可使NK 细胞长期发挥细胞毒作用，抑制肿瘤细胞的生长[1]。Park JI等用热水和碱水从一种韩国药用植物黄柏的皮层中提取、分离纯化得到一种杂多糖，表现出有效的B 淋巴细胞刺激活性[2]。
3.1.3 多糖对抗体生成的影响
抗体与抗原特异结合，可直接中和具有毒性的抗原分子；抗体结合抗原后形成的复合物易被吞噬细胞吞噬清除；抗体又可与抗原结合后，再结合补体，使补体活化，杀伤病原体。Han SB等报道，从Platycodon grandiflorum (PG)根中分离的一种多糖能够显著地增加IgM 的产生，促进B 细胞增殖，刺激巨噬细胞内一氧化氮合酶(iNOS)的转录和产生[7]。Nergard CS等发现Vernonia kotschyana的根茎可以治疗胃炎、十二指肠溃疡，而从其根茎中提取的多糖具有促进B 细胞增殖、激活T 细胞的作用[8]。
3.1.4 多糖对细胞因子分泌的影响
细胞因子是由活化的免疫细胞和某些基质细胞分泌的一类小分子糖蛋白，具有多样生物学作用，包括促进靶细胞增殖分化、增强对感染的抵抗力、参与调节机体的免疫应答和炎症反应、影响细胞代谢等。从Phellinus linteus中提取的PL 多糖，通过产生NO 和TNF α抵抗Yac 1细胞的毒性作用，而起到免疫调节和抗肿瘤作用[9]。Anastase Ravion S等在研究天然硫酸化多糖的免疫调节特性时发现，葡聚糖衍生物和褐海藻能影响LPS ，刺激M φ引起的致炎细胞因子释放[10]。
3.2 多糖的抗肿瘤作用
多糖溶于水是其发挥生物活性的前提。作为药物多糖的研究已给肿瘤的化疗开辟了新的领域。Wang JC 等研究发现，通过调整C/N比例、pH 值、温度，从Pleurotus citrinopileatus 中提取的主要由葡萄糖和甘露糖组成的可溶性多糖SPPC ，可以显著增加肺转移性肿瘤小鼠体内T 细胞、CD4(+)细胞、CD8(+)细胞和巨噬细胞数量, 抑制肿瘤细胞的增殖[11]。从枸杞中提取的多糖蛋白质复合体LBP3p 能作用S180肉瘤小鼠的免疫系统，表现为增强巨噬细胞的吞噬活性，促
进淋巴细胞增生，增强细胞毒性T 细胞活性，增加IL 2 mRNA 的表达，同时减少S180小鼠脂质过氧化[12]。Ji YB等研究发现，S180小鼠与正常小鼠比较，其红细胞膜上带3蛋白含量呈明显下降趋势，而且出现交联蛋白，小鼠红细胞微粘度升高，膜脂流动性下降。而药用和食用仙人掌多糖都可提高荷瘤小鼠红细胞膜带3蛋白的含量，降低交联蛋白的形成，改善膜脂流动性，降低荷瘤小鼠红细胞膜的微粘度，从而部分恢复、提高红细胞膜结构的完整性与生理功能的正常性，增强红细胞免疫功能，这可能是仙人掌多糖抗肿瘤作用的机制之一[13]。从韩国红人参中提取的红人参酸多糖(RGAP)，通过刺激巨噬细胞产生NO 调节免疫和抗肿瘤。研究发现，RGAP 和紫杉醇在小鼠S180肉瘤和B16黑色素瘤的联合治疗中可起协同作用。RGAP 可呈浓度依赖性的刺激脾细胞分泌IL 6，同时拮抗紫杉醇对NK 细胞活性的抑制作用[14]。Liu JJ 等研究发现，从樟脑菌丝中分离纯化的多糖AC PS ，通过激活单核细胞而抑制人白血病U937细胞的增殖，抑制率约达55.3%[15]。
3.3 多糖的抗炎作用
抗炎活性的多糖在国外研究较多的是细菌荚膜多糖，其中脆弱类杆菌(Bacteroides fragilis) 荚膜多糖的抗感染活性研究的较为深入[16]。脆弱类杆菌的荚膜多糖分为两种组分：Ps A和Ps B。这些荚膜多糖居于细菌表面，形成脆弱类杆菌的所谓荚膜多糖复合物(capsular polysaccharide complex,CPC)，具有显著的生物活性。其中Ps A活性较强，在体外具有T 细胞增殖活性[17]，在体内具有抗脓肿形成作用[18]。来源于真菌细胞壁的β
有抗炎作用。服用可溶性β(1～3) 葡聚糖也具(1～3) 葡聚糖，能够显著增加动物体内参与循环的中性粒细胞数量，还可提高单核细胞和中性粒细胞抗微生物的活力，增强巨噬细胞的功能，并刺激骨髓造血[19]。服用PGG 葡聚糖[一种高度纯化的具有β(1～6) 分支的葡聚糖]的动物进行血培养，和对照组相比，可检出较少的微生物数量。一次性注射PGG 葡聚糖的小鼠或大鼠，其白细胞总数出现一过性升高，即使在感染后4 h 服用PGG 葡聚糖也能显著地降低死亡率[20]。来自一种菌丝体的胞外多糖(exopolysaccharides,EPSs)，也具有抗炎活性，腹腔注射能够显著提高小鼠对产单核李斯特菌感染的抵抗力，在体内能够诱导淋巴细胞的增殖
[21]。当发生急性炎症时，炎症因子与抗炎症因子间存在着平衡关系，影响着炎症发生的进程。当机体感染细菌后，多种炎症介质迅速释放，包括TNF α、IL 1、IL 6和IL 8；数小时后，抗炎症因子如IL 10、MCP 1产生，以对抗炎症反应。此外，这些细胞因子能够直接抑制炎症因子的生成或促进特定细胞因子抑制剂的合成，如IL 1受体和可溶性TNF 受体；也可下调趋化因子及其受体和Th1细胞因子的水平。抗炎的机制一般认为是促进免疫细胞的活性，下调炎症因子如TNF α、IL 1、IL 6和IL 8，上调抗炎症因子如IL
10和MCP 1等[22]。Glucuronoxylomannan (GXM) 是Cryptococcus
neoformans 中主要的荚膜多糖，它上调抗炎因子IL 10表达的同时抑制IL 2的表达而达到抗炎作用[23]。
3.4 多糖的抗病毒作用
某些多糖或衍生物对各种病毒有抑制作用，如人免疫缺陷病毒(HIV)、单纯疱疹病毒(HSV)、人巨细胞病毒(HCMV)、流感病毒、囊状胃炎病毒、劳斯肉瘤病毒和鸟肉瘤病毒等[24]，这些多糖大都含有硫酸基。其作用机制除了从整体上调节机体免疫能力外，还可以在两方面产生抗病毒作用：①竞争抑制病毒对靶细胞的粘附和穿透。HIV 1反式激活因子在细胞外攻击靶细胞如CD4(+)和内皮细胞起作用，而大肠埃希氏杆菌多糖的硫酸化衍化物具有与肝素相似结构，但没有抗凝血活性，可以作为HIV 1反式激活因子拮抗剂而起到阻止HIV 病毒对靶细胞的粘附和穿透作用[25，26]。从Prunella vulgaris中提取的多糖具有竞争抑制HSV 1，2的细胞粘附位点而抑制病毒的穿透[27]。②抑制病毒增殖。一些硫酸化的海藻多糖具有抗包膜病毒的能力，疱疹单纯病毒通过包膜表面蛋白C 和靶细胞表面硫酸乙酰肝素结合而进入细胞内，而海藻多糖可抑制此结合。红海藻多糖片断F6不仅能有效的抑制疱疹单纯病毒I 型的复制，而且还可选择性的抑制疱疹单纯病毒II 型、人巨细胞病毒、流感病毒A/B型、塔卡里伯病毒的增殖[28]。
3.5 多糖的抗凝血活性
目前报道具有抗凝血作用的多糖多为来源于海藻的硫酸化多糖。其抗凝机制可能有：① 同抗凝血酶结合，诱导其改变构型，从而将其激活。②对一种血清蛋白酶抑制因子(肝素辅因子Ⅱ) 的激活[29]。肝素是内源性抗凝血物质，属于含硫酸基的糖胺聚糖，带有负电荷，它主要通过增强抗凝血酶(肝素辅助因子II ，HCII) 的作用来抗凝血。从海藻中分离到多种结构的硫酸化岩藻聚糖或硫酸化D 半乳聚糖，它们的抗凝血活性与化学结构、相对分子质量和硫酸基含量有关，它们能提高抗凝血酶因子Ⅲ(ATW)或肝素辅助因子Ⅱ的活性，从而抑制凝血过程所必须的丝氨酸蛋白酶、凝血酶的活性而发挥作用[30]。从人参根中提取的一种酸性多糖，由半乳糖、阿拉伯糖和糖醛酸组成，也具有抗凝血活性[31]。
3.6 多糖的抗衰老作用
一些植物或微生物来源的多糖具有抗衰老活性。一方面这类多糖作为免疫调节剂上调机体的免疫功能；另一方面可以增强机体对自由基的清除能力和抗氧化能力[32]。芦笋多糖为禾本植物芦苇嫩苗的提取物，它可明显拮抗D 半乳糖所致衰老小鼠免疫器官及组织的萎缩，使皮质厚度增加，皮质细胞数增加，脾小节增大及淋巴细胞数增加[33]。
3.7 多糖的降血糖作用
Huang ZX等发现从Spirulina platensis和Sargassum thunbeergii提取的多糖PSP 和PST 按1∶1组成的复合物具有降低四氧嘧啶所致的糖尿病小鼠血清血糖、TC 、TG 、 NO、ET 和增加HDL C 的水平
4 多糖类物质的研究方向
近20年来, 国内外各类多糖物质不断进入临床, 主要集中在抗感染、 抗肿瘤、 抗风湿、 抗消化道溃疡和增进免疫功能等方面。其报道的临床药理和适应
征各有异同, 多糖的基本结构也各有异同, 但大多数研究是基于体内外病理模型的药效学实验, 而缺乏其糖链的基本结构、 体内代谢以及体内相应配体作用机理的研究。因此每种多糖物质的多向药效作用过于笼统, 药理机理与结构基础研究尚在发展。目前多糖物质的进展有两方面:一是根据多糖本身在消化道药理与药代动力学原理, 发展新型的降血脂、 抗脂肪肝、
抗高血糖、 促进免疫功能等的治疗研究。二是依据多糖分子结构为基础而阐明的生物学现象, 合成与模拟体内多糖分子或相应配体, 或比天然多糖分子更有效的衍生物或类似物用于疾病治疗。国外基于先进的基础研究大力发展此类物质, 在抗炎症、 抗肿瘤与抗病毒感染等方面已取得较大进展。
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