促凋亡蛋白Bid诱导肝细胞凋亡的机制

ISS N 　100727626C N 　1123870ΠQ

中国生物化学与分子生物学报

2004年10月20(5) :670～674

促凋亡蛋白Bid 诱导肝细胞凋亡的机制

白　莉, 　曹传平, 　张映辉, 　毛高平

(空军总医院消化内科, 北京　100036)

α或抗摘要　为研究促凋亡蛋白Bid 对肝细胞凋亡过程中的调节机制, 在体内和体外分别用T NF 2

Fas 抗体诱导小鼠肝细胞凋亡. 免疫荧光染色观察Bax 转位和构象变化; 采用E A caspase 23

α或抗和8的活性;Western 印迹测定Bid 和Bax :T NF 2Fas 抗体通过激活Bid 导致Bax 转位和构象变化, 使Bax . 阻断Bid 的作用, 则Bax , 胞调亡可能受Bid 调节关键词　, , , of H epatocytes Apoptosis I nduced by Proapoptosis Protein Bid

BAI Li

,C AO Chuan 2ping ,ZH ANG Y ing 2hui , M AO G ao 2ping

(Department o f Digestive Diseases , G eneral Air Force Hospital , Beijing 　100036, China )

Abstract 　T o investigate the mechanism of hepatocytes apoptosis induced by proapoptosis protein Bid , m ouse

αor Anti 2Fas primary hepatocytes were is olated from wild type and Bid deficient mice and treated with T NF 2

antibody to induce cell apoptosis. Immunofluorescence staining of Bax was processed to recognize Bax translocation and its con formation change. The wild type or wild type mice trans fected with the adenovirus carried DN 2FADD (dominant negative 2Fas ass ociated death domain ) and Bid deficient mice were injected with anti 2Fas antibody 2hours before sacrificed. Caspase 3and 8activities were measured. Bid cleavage bands and Bax con formation change bands were detected by Western blotting. The results showed that during death

αor anti 2Fas antibody induced hepatocytes apoptosis , Bax translocation and receptors including T NF 2

con formation change through activating Bid , which caused Bax to insert to mitochondria membrane of hepatocytes. The translocation and insertion of Bax were blocked when Bid was knocked 2out or blocked , and hepatocytes apoptosis was delayed or inhibited. S o it is postulated that hepatocytes apoptosis induced by death receptor might be regulated by Bid , and Bax translocation and insertion dependent on Bid. K ey w ords 　apoptosis , hepatocytes , Bid , translocation , insertion

　　Bax 在细胞凋亡过程中以寡聚体的形式在细胞的脂质膜内形成一通道. 在分离出的线粒体上, Bax 单体不能触发细胞色素c 的释放, 当形成寡聚

[1]

有活性的tBid (truncated Bid ) . 然而, 在肝细胞凋亡过

程中, 它们是如何起作用的还不十分清楚. 为了进一

α和抗Fas 抗体步弄清Bid 作用机制, 本文应用T NF 2

在体内和体外分别诱导野生型和Bid 缺陷小鼠肝细

胞. 结果发现:在细胞凋亡过程中, 发生Bax 转位和插入,Bax 转位受多种刺激诱导, 属非特异性, 但其构象变化和插入到线粒体膜则发生在Bid 被活化之后, 当Bid 被阻断后,Bax 的插入消失, 提示Bid 是通

收稿日期:2003212203, 接受日期:2004202210

体时, 它的这一作用则显现出来. 在正常细胞,Bax 以可溶性单体蛋白形式存在于细胞浆或松散地结合于线粒体, 在凋亡因素的诱导之下,Bax 转位到线粒体, 在线粒体上形成较大形式的寡聚体, 后者可插入进线粒体膜

[2～4]

. Bax 寡聚体对跨膜通道的形成和凋

[5]

亡因子进出线粒体起一定作用. Bcl 22蛋白家族中Bid 是仅有BH3区域的促凋亡蛋白, 抗Fas 抗体或

α通过激活死亡受体而使无活性的前caspase 活T NF 2

化为有活性的caspase 28, 后者激活Bid 使之裂解为

联系人　T el :[1**********], E 2mail :bai-li @hotmail.com

C orresponding author T el :[1**********],E 2mail :bai-li @hotmail.com

Received :December3,2003;Accepted :February 10,2004

第5期白　莉等:促凋亡蛋白Bid 诱导肝细胞凋亡的机制671　

过调节Bax 的插入起促凋亡作用的, 而且,Bax 在死

亡受体诱导的凋亡途径中, 其功能是依赖于Bid 的. 　　

1　材料和方法

111　动物

Bid 缺陷型和野生型C57BL Π6J 雄性小鼠,18～23g , 饲养在无病原的环境下.

112　原代肝细胞的分离及细胞培养和凋亡的诱导

羊抗兔过氧化物酶共扼的二抗室温温育1h , 荧光底

物作用(EC L 药盒) 3min , 暗室内显像. 117　C aspase 3和caspase 8活性的检测

在96孔板内加入20μg 细胞质, 检测caspase 3活性, 加入2m ol ΠL DE VD 2AFC , (Asp 2G lu 2Val 2Asp 2aminotrifluoro 2methyl 2coumarin ) , 测caspase 8活性, 加入2m ol ΠL IET D 2AFC (Ile 2G lu 2T yr 2Asp 2aminotrifluoro 2methyl 2coumarin ) , 补充液体量至200μl ,30℃温育2h ,400nm 、505nm .

原代肝细胞分离采用经下腔静脉灌注胶原酶方

法, 离心去除未消化的纤维组织、红细胞等, 细胞成活率经台盼蓝染色方法鉴定. 细胞用含10%胎牛血清的DME M 培养液培养. 取贴壁2h α10ng Π用T NF 2ml +Act 2D ng 育4h , 加入Πml 避光染色30, 50%甲醇+50%乙醇溶液固定10,P BS 浸泡下4℃避光存放待用. 113　体内小鼠肝细胞凋亡的诱导

经小鼠尾静脉注射0. 25μg Πg 抗Fas 抗体,2h 后杀鼠, 留取肝脏制备肝细胞线粒体和细胞质, 经BC A 药盒(Pierce ) 测定蛋白含量后保存在-80℃. 114　免疫荧光染色

α处理固定的细胞用P BS 洗3次后, 分经T NF 2

别用兔抗鼠Bax 多克隆抗体(062499, Upstate Biotechnology ) 和鼠抗小鼠单克隆抗体(6A7) 温育细胞过夜,P BS 洗3次后, 分别加入荧光标记的羊抗兔(Cy2, Amersham Pharmacia Biotech ) 或抗鼠二抗(Cy3) 温育40min ,H oechst 33342染色细胞核, 在荧光显微镜(Olym pus Provis ) 和共聚焦显微镜(C on focol microscopes , Nikon Eclipse ) 下观察并照相. 全部操作避光进行. 115　病毒转染

纯化的携带DN 2FADD (Fas 相关的死亡受体结合区) 表达片段的腺病毒(匹斯堡大学医学院病理系

Y in 博士提供) 1×10PFU 经小鼠尾静脉快速注入,

g Πg 抗小鼠FAS 抗48h 后再次经尾静脉注射0. 25μ

体,2h 后杀鼠, 留取肝组织进行线粒体和细胞质分

离. 阴性对照采用表达荧光素酶的腺病毒. 116　Western 印迹

取50μg 线粒体和细胞溶质标本在2%S DS 2PAGE 分离, 然后转移凝胶上的蛋白至PVDF 膜(Bio 2Rad Laboratories ) , 用5%脱脂牛乳非特异性阻断1h , 分别用兔抗Bid 和抗Bax 抗体室温温育2h (美国匹斯堡大学医学院病理系Y in 博士实验室提供) , 加入

212h 后, 取小鼠肝脏固定在4, 常规制备石蜡切片. 与非治疗组比较, 野生鼠在抗Fas 抗体处理后迅速发生肝脏损伤, 肝细胞显示有凋亡特征, 如核固缩, 正常肝细胞形态的消失, 肝实质结构的破坏, 由于内皮细胞的损伤, 大量红细胞渗透到肝实质内. 而在bid 缺陷鼠无明显上述表现.

212　免疫荧光染色结果

α温育4h 后收获细野生型原代肝细胞用T NF 2胞, 经甲醇和乙醇1∶1固定10min 后, 用抗2Bax 抗体(06499, 识别人Bax 的氨基酸序列1～21) 染色后显微镜观察. 发现未经处理的肝细胞Bax 蛋白均匀分

α处理后,Bax 呈颗粒状分布, 布在胞浆内, 经T NF 2

加用线粒体的示踪物, 发现Bax 蛋白(绿色) 与线粒

α诱导Bax 体的示踪物(红色) 重合, 从而证实了T NF 2

转位的现象(Fig. 1) .

Bax 构象变化观察:野生型和Bid 缺陷小鼠肝细

胞经可识别构象变化的抗Bax 的抗体(6A7, 识别人Bax 的氨基酸序列12～24) 进行免疫荧光染色. 未经

α处理和处理的Bid 缺陷肝细胞6A7染色阴性, T NF 2

处理后的肝细胞可见6A7阳性染色(Fig. 2) . 213　C aspase 酶活性分析

野生型和Bid 缺陷的小鼠静脉给予抗Fas 抗体诱导肝细胞凋亡,2h 后杀鼠, 制备肝组织匀浆, 采用荧光底物分解方法, 用荧光分析仪测定肝细胞浆内caspase 28和caspase 23的酶活性. 为进一步确实Bid 的作用, 采用携带DN 2FADD (dominant negative Fas ass ociated death domain ) 的腺病毒转染野生型小鼠的肝脏, 特异性阻断死亡受体信号途径, 病毒转染48h 后同上方法诱导肝细胞凋亡. 注射抗Fas 抗体的小鼠做阳性对照, 仅病毒转染的小鼠做阴性对照, 结果如Fig. 3所示,DN 2FADD 阻断死亡受体(抗Fas 抗

672中国生物化学与分子生物学报20卷

Fig. 1　Immunofluorescence staining

of Bax (A ) Bax ; (B ) M itotracker ; (C ) M erged

Bax immunofluorescence staining was detected by on type 6after anti 2Fas antibody treatment (Bax , ; ) Bax and mitotracker merged together , locates on mitochondria

Fig. 3　M easurement of caspase activity

Caspase 3and 8activities were measured by fluorescence analyzer Jo2+F represent anti 2Fas antibody (Jo2) injection after trans fection of adenovirus with DN 2FADD ; 0. 25, 0. 5and 1. 0represent total

Fig. 2　C on formation changes of Bax

Immunofluoresence staining on wild type hepatocytes , Bax positive

adenovirus concentration of 0. 25, 0. 5and 1. 0×109PFU , respectively. K O +Jo2represent Bid deficient m ouse (ko ) injected with anti 2Fas antibody. Y 2axis represents caspase3activities (black bar ) or caspase 8activities (blank bar ) in extracts of liver using Ac 2DE VD 2AFC or IET D 2AFC as substrate , respectively. DN 2FADD only serves as negative control ; Jo2only serves as positive control. Data are x ±s from three independent experiments

αtreatment , cells (B ) can be found on the cells with 8hours T NF 2

no staining on non 2treated (A ) cells , nuclei are blue (C versus A ,D

versus B )

体) 诱导细胞凋亡的作用是剂量依赖性的, 当DN 2

FADD 的剂量达到一定程度时, 几乎可完全阻断肝细胞的凋亡, 与阴性对照或Bid 缺陷的动物相似. 214　Western 印迹结果见Fig. 4. 首先显示一个现象, 在Fas 抗体和转染的病毒刺激下,Bax 蛋白由细胞浆转位到线粒体上, 与野生型鼠比较,Bid 缺陷型鼠在同样刺激下, 仅少部分Bax 发生转位. 这一结果提示,Bax 的转位是非依赖于Bid 的. 第二个现象是在Fas 抗体处理的野生型鼠, Bid 被水解为15kD 缩短的Bid (tBid ) , 同时在线粒体标本的泳道上, 出现了另一Bax 蛋白条带, 是由于Bax 在N 末端的一段氨基酸

在被激活后水解, 使其N 末端20～30个氨基酸缺失, 发生构象变化Bax 不仅由原全长21kD 缩短为19kD , 而且可插入到线粒体膜,tBid 和构象改变的Bax 在碱性液处理后, 都不能使之去掉. 相比较, 其

他刺激诱导的, 不伴有活性的tBid 的标本中,Bax 转位经碱性液洗涤后, 全长和构象变化的Bax 条带消失, 提示转位的Bax 是较松散地黏附在线粒体上. DN 2FADD 可阻断抗Fas 抗体诱导的Bax 构象改变以及插入, 对照病毒荧光素酶加抗Fas 抗体无抑制作用, 提示Bax 的构象变化和插入是依赖于Bid 的.

(Jo2) 或T NF 2α经FADD 和caspase 28首先在细胞浆

内介导无活性的p22Bid 水解产生一个主要功能片

段p15(tBid ) 和两个更小的片段p13和p11. tBid 转位到线粒体膜上触发线粒体释放细胞色素c , 后者作用于效应子caspases , 最终使细胞发生凋亡. 然而, Bid 诱导细胞色素c 释放的机制仍不清楚. 已有的研究结果显示,Bid 似乎并不能通过激活线粒体渗透转化极使细胞色素c 释放, 但Bid 能激活Bak , 一个Bcl 22家族中的促凋亡蛋白, Bid 的一个下游靶点. , 可能是Bid 的BH3区域

[7,8]

. 在死亡受, Bax 首先转位到线, 使之能插入到线粒体膜, 从而激活线粒体膜上的通道开放, 细胞色素c 释放. 通过Bid 缺陷鼠模型或DN 2FADD 阻断Bid 激活的信号途径,Bax 的转位仍有发生, 但其构象变化和插入却完全被阻断, 提示Bax 的转位不是依赖于Bid 的, 但其构象变化和插入却有可能完全受Bid 的控制. 因此本文认为,Bid 诱导细胞凋亡是通过调节Bax 的构象变化而实现的,Bid 在死亡受体诱导的肝细胞凋亡中发挥了关键的作用. 然而,Bid 是通过何种方式使Bax 构象变化和插入的还不十分清楚. 313　凋亡蛋白对肝癌发生的影响普遍认为, 肿瘤的发生是异常细胞失去了对凋亡信号的反应, 使这部分细胞获得不死性或生存期明显延长. 基因的不稳定性明显增加, 细胞增殖比例大于细胞死亡, 二者之间失去平衡. 在先前的研究[10]

中, 我们暴露Bid 缺陷的鼠15mg Πkg 的基因毒性化学剂二乙基亚硝胺(DE N ) , 在DE N 暴露的较早期阶段观察到, 野生型小鼠肝组织内的细胞凋亡率(AI ) 和增殖率(LI ) 均高出Bid 缺陷小鼠的两倍; 在DE N 暴露后4个月, 野生型小鼠肝组织内癌前损伤结节的平均数量和面积也较Bid 缺陷小鼠明显增多. 分析原因后认为, 这可能是因为肝细胞对DE N 损伤刺激的反应是细胞凋亡, 凋亡又诱导了细胞的增殖, 而发生DNA 损伤的肝细胞较正常肝细胞具有更大的增殖潜力, 形成有遗传物质改变的、生长力旺盛的细胞克隆, 也就是癌前结节. 因此, 我们在这一动物模型的研究结果提示:促细胞凋亡蛋白Bid 或许能够通过诱导凋亡参与了肝癌发生的的过程, 并可能在肝癌发生的早期起促癌剂的作用. 但不排除Bid 在诱导肝细胞凋亡的同时, 还具有其他方面的功能, 如参与细胞周期的调节等.

[9]

Fig. 4　W estern blot analysis of Bid and Bax after anti 2Fas antibody treatment with or without DN 2FADD trans fection on wild type and Bid deficient mice

NT:N2terminal con formational changed Bax ; tBid :truncated Bid ; C ox IV and β2actin :control of mitochondria and cytoplasm protein , respectively

3　讨论

311　在肝细胞内由死亡受体诱导的凋亡受Bid 的

调节

Bid 是Bcl 22家族蛋白中的一个促凋亡蛋白, 凋亡刺激经抗2C D95抗体、DN 2FADD 和caspase 28激活[8]

Bid , 最终使效应caspase 激活而触发细胞凋亡, 即死亡受体途径. 在某些细胞, 如淋巴细胞缺乏Bid , 凋亡的刺激是通过Bax ,Bcl 22家族蛋白中的另一个促凋亡蛋白, 使线粒体释放细胞色素c , 后者激活caspase 29等诱导细胞凋亡, 即线粒体途径. 这些研究发现提示:细胞凋亡可能是通过两条完全不同的信号传导的, 最终都是通过激活效应子caspase. FADD 在死亡受体途径中作用是征集和激活caspase 28; caspase 28通过裂解Bid 为tBid 使之激活. 用DN 2FADD 阻断FADD 的作用或CrmA , 一种牛痘病毒,

抑制caspase 28,Bid 的裂解均受到抑制, 至少在肝细胞内的凋亡明显延迟发生或可能不发生. 312　B ax 转位和插入依赖于Bid

先前的报道及我们的结果显示, 由死亡受体诱导的细胞凋亡是依赖于Bid 的. 在体内, 抗2Fas 抗体

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