水华微囊藻分离及其鉴定技术研究进展
聂晶晶1 ，铁程2 ，金玉2，殷丽萍2，李元1 ，杨良 2
摘要：我国是蓝藻水华分布最广，受影响最大的国家之一。水华的普遍发生，使水体的感官性状恶化，水体自净能力降低。有毒蓝藻的研究也是目前热点之一；微囊藻毒素(Microcystins，MC) 是一种在蓝藻水华污染中出现频率最高、产生量最大和造成危害最严重的藻毒素种类。对其研究十分必要。但在微囊藻分离培养以及分离后纯种的鉴定研究方面还存在许多难点。本文介绍近几年来在水华蓝藻分离培养和鉴定技术方面的研究进展。
关键词：分子鉴定 蓝藻 水华 分离 培养
前言：湖泊、水库和河流中接纳过多的氮和磷等营养物质，使水体的生态结构与功能发生变化，导致藻类特别是蓝藻(Cyanobacteria)的异常繁殖生长而出现的蓝藻水华现象。当蓝藻水华严重时，水面形成厚厚的蓝绿色湖靛，散发出难闻的气味。不仅影响人的感官、破坏了健康平衡的水生生态系统，而且因藻细胞破裂后释放出了多种藻毒素而对人和动物的饮用水安全构成了严重的威胁。世界上25％～70％的蓝藻水华污染可产生藻毒素，在已发现的各种不同藻毒素中，微囊藻毒素(Microcystins，MC) 是一种在蓝藻水华污染中出现频率最高、产生量最大和造成危害最严重的藻毒素种类。纯种藻的分离和培养十分必要，然而藻类的分离培养有很多因素制约，如藻细胞普遍比较小，而且很多藻细胞聚集在一起也对分离造成了很多的困难。很多科研单位从藻种提供单位购买，不仅增加了研究支出，而且特异性的地区藻类的进化和遗传有很大差异。科研单位有必要独立解决藻类的分离培养技术。分离培养的纯种藻需要定性说明是什么藻，所以藻的鉴定也是十分必要的。
1. 藻类分离培养
藻类的分离方法就是为了提供纯种藻作为基础和应用研究的材料，也是今后开展藻类增长潜力试验(简称AGP 试验) 不可缺少的手段之一。藻类培养首先要有藻种。从天然水域的混杂生物群中，用一定方法把所需藻类个体分离出来，而获纯种培养。这种方法称为藻种分离和纯化，又称纯培养法。真正的“纯种培养”是指在排除包括细菌在内的一切生物的条件下进行的培养。这是进行科学研究不可缺少的技术，而在生产性培养中不排除细菌的称之为“单种培养”。要想从水体中分离出试验所需的纯种藻必须经预备培养；藻种分离；纯种培养；保种这四个步骤。
1.1 藻种分离
细胞藻类的分离方法按照培养载体分为：固体培养基法、液体培养基法。
1.1.1 固体培养基法
(1) 半固体稀释倒平板法：
先将待分离的材料用无菌水作一系列的稀释，然后分别取不同稀释液少许，与已溶化并冷却至35℃左右的琼脂培养基（200 mL培养基加入0.5g 琼脂）混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含藻的琼脂平板，保温培养一段时间后可出现菌落。如果稀释得当，在平板表面或者琼脂培养基中就可出现分散的单个藻种，然后挑取该单个藻株，或重复以上操作数次，便可得到纯的单种藻。
(2) 涂布平板法[1]：
由于将含藻材料先加到较热的培养基中再倒平板易造成某些热敏感的藻类死亡，而且采用稀
释倒平板法也会使一些 严格好氧的藻类被固定在琼脂中因缺乏氧气而影响生长，因此更常
用的纯种分离方法是涂布平板法。其做法是先将已溶的培养基倒入无菌培养皿中，冷却后将
一定量的某一稀释度的样品悬液滴在平板表面，再用无菌玻璃涂棒将藻液均匀分散至整个平
板表面；还有种做法是把稀释藻液装入消毒过的小型喷雾器中（如医用喉头喷雾器），打开
培养皿盖，把藻液喷射在培养基平面上，形成分布均匀的薄层水珠。经培养后挑取单个藻株。
(3) 平板划线分离法：
用接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料，以无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其
他形式的连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐渐分散开来，如果
划线适宜的话，微生物能一一分开，经培养后，可在平板表面得到单种。
1.1.2 液体培养基
对于有些藻类用固体培养基分离效果通常是满意的，但是有些藻类需要用液体培养基分
离来获得纯培养。培养微囊藻常用液体培养基有HGZ 、MA[2]、BG11等。单细胞藻类单种液
体培养基分离常用下列三种方法：微吸管分离法，水滴分离法，稀释分离法[3]。
(1) 微吸管分离法：
将稀释适度的藻滴水样，滴于凹玻片上。在显微镜下用微吸管挑选要分离的藻体， 认真仔
细地吸出放入另一个凹玻片上，在显微镜下观察该滴藻液中是否达到纯分离目的，如不成反
复几次，直至达到分离目的为止。然后移入经灭菌的培养液中(一般在20mL 试管中装入培养
液2～4mL) 进行培养。此法操作技术要求高，要细心。往往吸取一个细胞，要反复几次才能
成功。因为微囊藻个体较大，一般这种方法比较常用，但对操作者要求较高。
(2) 水滴分离法：
用微吸管吸取稀释适度的藻液，滴到消毒过的载玻片上，藻液水滴尽可能小些，要求在显徽
镜低倍镜视野中能看到水滴的全部或大部。一载玻片滴2滴，水滴作直线排列，互相间隔一
定距离，在显微镜下详细观察每一滴藻液。如果一滴藻液内只有一个或几个所需要分离的同
种藻类细胞，无其他生物混杂，即用吸管把这一滴藻液冲入装有培养液并经过灭菌的三角瓶
中， 如不成反复几次直至成功。水滴分离法简便易行，适宜于分离在培养液中占优势的藻
种。
(3) 稀释分离法：
把含有需要分离的藻类而又混杂有其他生物的水样，取其一定量，用培养液稀释。通过稀释
到适宜程度的方法，达到把原混杂生物单个分离培养的目的。首先把水样稀释到每一滴含有
一个左右的生物细胞，在稀释过程中配合显微镜检查，调节稀释度，然后准备装有1/4容量
培养液的试管20支，每一试管加入稀释适宜水样一滴，摇匀，进行培养。待藻类生长繁殖
达一定浓度时，再检查是否达到分离目的，若未达到，再重复做。此法操作简单易行，但有
一定程度盲目性，比不上水滴分离法效果。
纯种培养将毛细玻璃管吸取的单个藻体，用吸嘴吸入装有50mL 培养液的100 mL三角瓶中，
用灭菌纸封口放入培养架上进行培养。当藻增多长大后，用灭菌环取1滴藻液镜检，如果有
几种藻同时存在，要重新分离，直到分离出纯种藻体。在实际操作中，也可结合两个方法，
先固体培养基，优点是缩短培养周期，固体培养也容易挑取，再用液体培养基法，进一步纯
化。
2. 藻种培养
将确定为单种藻并且达到对数生长期的蓝藻移进l3号(112um)浮游植物网，用去离子水洗净
后，移到试管中，用50W 超声波处理30s ，将群体打碎，再按照上面的分离纯化方法进行
操作，直至得到无菌株。
2.1 保种
保种为了保证分离出来的单细胞藻种的成活，需定期将它移入新的培养液中，待藻种在新的
培养液中长成后， 便可将它放在低温、弱光下保存。保种时需要注意防止藻液污染。通常
用液体培养基保存藻种接种一次只能保存1～2个月，而用固体培养基保存藻种接种一次可
以保存半年到一年。保种用的固体培养基的营养物浓度应高于液体培养液，一般可增加一倍。
琼脂量为1％～1．5％, 而且现在对于藻类也可适当的减少琼脂量，使其制成半固体培养基，
实践中也获得不错的效果。
2.2 大量培养
微囊藻培养包括接种、培养、采收等。
（1）接种：一般要求选取生活力强、生长旺盛藻种。可先将浓缩藻种用连续稀释法，制备
一定浓度的悬浮藻液，然后接入培养容器。接种时注意藻种和培养液比例要适当，使藻细胞
在新培养液中达到一定数量。使一开始培养，藻类在培养液中占优势，另一方面还可缩短培
养周期，这是培养得到成功的经验之一。在环境条件不很适合情况下，更需提高接种量。一
般所用藻种浓度，根据藻类体积大小，每毫升30万～300万个，采用1∶2～1∶5的比例。
还需注意接种时间，在自然光条件下，最好在上午8～10时，不宜在晚上。
（2）培养管理：主要是使已接种培养物在相对稳定适宜环境中大量繁殖生长。要注意以下
因素：
1）二氧化碳浓度：在开放式不通气方法培养中，搅拌是十分必要的，可以增加水和空气的
接触面，使空气中二氧化碳溶解到培养液中，而且帮助沉淀藻类细胞上浮获得光照。在通气
培养中，培养液内应维持二氧化碳浓度在0.1～5％之间。
2）光照强度：利用太阳光源培养时，一般在室内培养可放在近窗口地方，防止强直射光照
射或利用人工光源（60～100Ｗ电灯或日光灯），需1500～3000Ix 。
3）温度：适温一般在10～30℃之间，最适温常为20～25℃。若在室外培养，夏季中午高
温，冬季早晚低温，常造成不利影响，需设法调节。
4）无机营养：应不断添加新鲜培养液，及时补充被藻吸收后减少了的某些元素。
5）注意pH 变化：变动过大，可用酸、碱调节。
6）适当控制培养物中藻细胞浓度：过高会引起光照和无机营养不足，并导致pH 上升。一
般控制在0.3g （干重）/L范围内。
7）及时观察和检查藻类生长情况：可以通过培养物呈现的颜色、藻类细胞运动情况、是否
有沉淀附壁、菌膜及敌害生物污染迹象等观察而了解一般的生长情况。藻种培养每半月进行
一次全面显微镜检查。大量培养中发现有不正常现象，应立即镜检，目的有两个：了解藻细
胞生长情况，并检查有无污染。
（3）采收：通常在培养物细胞浓度达到干重0.4～0.5克/升时，即可采收培养总量1/3的藻
体。采收时，先搅拌培养物，取出1/3量藻液，置于沉淀缸中，加入2％～3％明矾或6％饱
和石灰水。约1～2小时，藻细胞即可完全沉淀，取出沉淀，离心、浓缩、冻干。
3. 微囊藻鉴定方法
藻类在监测湖泊、水库等水体的水质状况时起着极其重要的作用，国内外已广泛应用藻类作
为生物监测、评价水质污染程度的重要指标。
3.1 物理方法
藻类识别统计的物理方法原理是根据不同类藻都有表明其身份的特征，如形态学上形态大
小、色素、色素体、贮藏物质等的差别来辨别不同种的藻类细胞，微囊藻的物理方法分辨主
要是根据形态上的空间布局和群体的构型不同。目前从传统的碘量法发展了很多种方法。
（1）离心沉降法[3]：
准确量取5O ～100mL 水样于离心管，4000 rpm 离心10min ，小心倒扣弃去上清液，用滤纸
吸去管口余水，向管内加入少量生理盐水，旋涡振荡洗下粘附在管壁的藻细胞，定容至1～
2mL ，计算浓缩倍数，用于下一步镜检。离心沉降法检测水中藻类数目与传统的碘液固定法
结果没有显著差异，并具有①快速检测(操作熟练者半小时可以出结果) ；②显微图像清晰(活
藻体，色素体等细胞结构没有破坏，易鉴定) ；③所需水样品量少(50～100mL) ；④不需用化
学药品等优点。
（2）显微彩色图像识别法[4]：
显微彩色图像处理在将制备的样本置于显微镜载标明藻类的种类和数量后，经1O0倍油镜
显微放大，通过CCD 摄像将获取的模拟图像信号输入图像采集卡中，并转换成Windows 位
图格式数字图像，保存在计算机中以备分析。在识别统计中，将待测样品的特征信息通过
CCD 摄像获得的模拟图象通过计算机终端转化信号，与计算机中的图象信息进行对比。
（3）免疫电镜技术识别：
大部分藻类都具有蛋白核(Pyrenoid)结构。最近国外研究资料认为蛋白核可能涉及光合功能
和CCM(CO2浓缩机制) ，Miyamura 等研究显示叶绿体DNA 位于蛋白核中。可见，蛋白核在
藻类叶绿体分子生物学、细胞生理及生物进化等方面都具有重要作用。为此，应用电镜技术
对几种藻类蛋白核超微结构进行了观察，应用对Rubisco 和Rubisco 活化酶进行分子定位。
利用制备的单克隆抗体和藻类表面抗原相结合的原理，可鉴别具有特定抗原的表面蛋白。利
用电子显微镜观察藻类细胞的微观结构来鉴定。还可以根据蛋白与特色染色剂进行特征染色
的特性，利用特定抗原的表面蛋白结合颜色的差异进行鉴别也是未来发展的方向。
3.2 分子生物学方法（PCR ）
传统的方法耗时长、劳动强度大、效率低，还存在着人为误差，非专业人员无法从事；并且
环境对藻类的形态有很大的影响，鉴定出具体的种存在的困难较多都此需要从分子上找出直
接的证据以鉴别。1985年由美国的莫里森发明了[1]PCR技术，该技术以其简便、快速、灵
敏、特异的特点，受到了分子生物学家的普遍重视。用于微囊藻毒株的鉴定和检测也是刚刚
兴起方法。
3.2.1 蛋白基因序列的测定鉴别微囊藻
编码蛋白的基因也可用来构建系统发生树，但由于这些基因存在的主要目的是其编码的蛋白
质在生物中所起的生理功能，因此只要蛋白质的组成或蛋白质的保守结构域不发生变化，他
们的就不会被淘汰。因此，功能性蛋白的基因能被用于进行更精细的藻种鉴定，在蓝藻中已
报道的几种用于分子鉴定的蛋白质基因包括藻蓝蛋白基因，DNA 依赖的RNA 聚合酶基因
ropCl ，和特定毒素合成有关的基因，和异形胞形成有关的基因。微囊藻的蛋白序列测定主
要是藻蛋白基因和微囊藻毒素合成基因。
3.2.1.1 藻蓝蛋白(PC)的序列测定
PC 是在蓝藻门，红藻门及隐藻门光合系统Ⅱ中天线色素分子之一[5]。其中蓝藻在淡水藻类
中是最常见的，蓝藻中整个PC 操纵子编码两个藻胆色素亚基β和a(分别定义为cpcB 和cpcA)
以及3个连接多肽[6]，cpcB 和cpcA 之间的基因间隔区(Intergenic Spacer，IGS) 是一个高变区，
不同种或株系的微囊藻在此段序列中会体现出不同程度的差异性，因此可用其对微囊藻种间
及种内以下关系加以区分[7-9]。利用PC 的IGS 序列的长度就能准确地预测来自水样中蓝藻
的属，PCR 产物的测序能区分不同的藻种[10]；Otsuka[11]等利用该技术研究了有毒和无毒微
囊藻之间的关系。他们检测了微囊藻的47个藻株的16S 到23S 核糖体DNA 内转录间隔序列。
结果表明，微囊藻可被划分为三群：第一藻群包括有毒和无毒藻株；第二群只有有毒藻株；
第三群只有无毒藻株。但用RAPD 扩增出现了多态性。所采用的藻蓝蛋白基因间隔序列(PC
—IGS) ，经证明是一个具有较高突变速率的区域，不同种或株系的微囊藻在此段序列中会体
现出不同程度的差异性，因此可用其对微囊藻种间及种以下关系加以区分。曾经报道过利用
PC 的IGS 序列能区分开巴西微囊藻的15个种[12]。我国学者钱开诚[13]等从PC —IGS 序列的差异性比较中可以看出该序列对于微囊藻而言有着较高的突变频率，适用于微囊藻种间的鉴定。这一点也可以从铜绿微囊藻与惠氏微囊藻的序列比对中得到证明(相似性仅为88.35％) ，这与Brett A．Neilan[14]等人的结论相符。
3.2.1.2 微囊藻毒素合成酶基因进行鉴别
1996年，Mei βner[15]等发现有毒和无毒微囊藻中都含有与已知的多肽合成酶基因同源的DNA 序列开始，到Tillett[16]等通过基因敲除和突变分析的方法报道了mcy 基因的全序列，这种产毒的微囊藻含有具同源性的肽合成酶基因保守序列，其中至少含有两个多肽合成酶基因，而微囊藻无毒株不具有这些基因。微囊藻毒素合成酶基因编码七个非核糖体肽链合成酶(NRPS)模块和聚乙酰合成酶(PKSs)，用来合成Adda 分子[17]。mcyA 、mcyB 、mcyC 编码NRPSs ；mcyE 、mcyG 编码NRPS —PKS ；mcyD 编码PKS ；mcyF 编码谷氨酸消旋酶，与微囊藻毒素分子中D —Glu 的合成有关[18]。人们针对微囊藻毒素合成酶基因中某一段基因设计特异性引物，在相应的反应体系中进行扩增，依据扩增出的相应片断进行定性分析。1999年Neilan[19]等直接从多肽合成酶和毒素合成酶基因中设计引物，来区分产毒和非产毒微囊藻。2001年Tillett[20]等为了调查微囊藻属是否产毒和种系发生之间的关系，曾专门针对微囊藻毒素合成酶基因mcyA 中的N 一甲基转移酶(NMT)域设计了一对PCR 引物(MSF和MSR) ，对35个微囊藻株进行实验研究。该实验结果显示：18个藻株存在NMT 域，并且在蛋白磷酸酶抑制试验中得出阳性结果；而其余17个无毒藻株均不存在NMT 域。2002年潘卉[21]等以国内水体中分离出的不同微囊藻藻株为研究对象，调查了mcyB 基因的分布情况，并利用PCR 技术鉴定毒性株。该次研究中建立的PCR 技术灵敏度高，可用来检测小于2000个藻细胞／mL 的水样是否存在mcyB 基因。
在这个研究领域，我国的研究人员开发出一种利用全细胞PCR 技术进行鉴别有毒微囊藻株系的方法，通过它不但可以快速准确地对实验室培养物进行鉴别，而且对自然水体中的微囊藻进行鉴别，因此对水体的安全评价有着重要的意义。班海群[22]等对西流湖水样进行全细胞PCR 扩增，PC —IGS 均呈阳性，mcyB 呈阳性结果，对mcyB 扩增产物克隆测序与Genbank 内的序列比对，测序结果与铜绿微囊藻的mcy 基因同源性大于97％ ，氨基酸同源性大于94％。司纪亮[23]等人利用对自然水体和实验室培养物进行的mcyD 的寡聚核苷酸引物参照引物mcyDF ，扩增mcyD 基因中的保守基元。对多株藻种进行了测序，通过对提取序列分析发现，mcyD 基因PCR 实验扩增结果与ELISA 检测结果相吻合，显示以mcyD 作为特殊的分子标志物检测水体中产微囊藻毒素和非产微囊藻毒素的蓝绿藻的方法是可行的。其序列一致性非常高，而不一致性极低，这显示目的基因保守程度极高，以这段序列设计的引物提高了检测结果的特异性、灵敏性。这种高度保守性可能与特殊的聚酮合成酶mcyD 负责微囊藻毒素中保守结构Adda 的合成有关mcyD 基因中的这个片段编码B-酮酰基合成酶和酰基转移酶功能域的一部分。翟超[24]等设计3对引物epF ／mblR ，mcF ／teR ，mcF ／umR ，通过全细胞PCR 的方法检测了l9种不同来源微囊藻产毒的情况，3种引物对l5株产毒微囊藻中均可扩增到预期大小的片段，测序结果证明这些片段是微囊藻毒素合成酶基因片段。张占会[25]等人也根据mcyB 的保守序列的特异性引物209F/409R 、27F1/409R 、MTR/MTF设计了三重全细胞PCR 方法可以同时产毒微囊藻和不产毒微囊藻，最小检出限为100个藻细胞／mL 。潘卉[26]等30株微囊藻藻株全细胞PCR 检测结果与常规PCR 、HPLC 、ELISA 、Bioassay 检测结果一致。检测下限低于100个藻细胞／mL 。
3.2.1.3 随机扩增的多态性DNA —PCR
Dittman[27，28]等从铜绿微囊藻HUB5—2—4中分离到一段称为mapepl 的DNA 片断，它能特异地与产毒微囊藻杂交，对这个片断的侧翼序列进行测序，发现其是由一个多肽合成酶基因家族组成；同时利用插入突变的方法敲断该基因发现它和微囊藻毒素的合成相关。因此，
在此基础上建立了一些检测产毒微囊藻的分子生物学方法。如随机引物扩增技术。
随机扩增的多态性DNA —PCR 技术是建立在常规PCR 技术基础之上的，利用随机的短脱氧核苷酸序列作为PCR 引物，对所研究的基因组DNA 进行PCR 扩增。扩增产物通过聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离，经EB 染色或放射自显影来检测扩增产物DNA 多态性。Nishihara 等对5种铜绿微囊藻进行分类研究，其结果与过去的同工酶分类相符，并找到一些种属特异条带[29]。RAPD —PCR 较常规PCR 反应更宜程序化[30]根据分子生物学原理研究，不难发现：RAPD —PCR 技术应用于微囊藻有毒与无毒株系的区分是基于微囊藻基因组的差别来进行的。利用短片段DNA 作为引物进行PCR 扩增，对于特定株系可以获得特定扩增条带组，据此准确的区分各个微囊藻的株系，并且结合原有的MC 的测定结果，可以快速地判定待测微囊藻是否产毒。该技术可用于水体中微囊藻的常规检测、年度间微囊藻组成的变化、水体中微囊藻株系分布等方面的研究[31]。2001年周晓明[32]等用微囊藻实验室建株的有毒和无毒株以及现场株系作RAPD 引物的扩增以及条带的对比，实验结果显示：三种株系微囊藻扩增的RAPD 引物各不相同，同种引物扩增出的条带也不相同，从而证明RAPD —PCR 技术可用于微囊藻的毒株快速分型。
3.2.3 其他方法
3.2.3.1 竞争性PCR 技术检测潜在产毒藻株
用核酸技术来进行环境监控的新方法虽然提供了较高的灵敏度和特异性，但对于它们的常规应用仍然存在一些局限性，例如在进行采样准备时通常是费力的，而且得出的复杂凝胶电泳条带也很难阐述。另外，由于环境样品的来源和质量有很大的变异性，所以使检测结果的可靠性产生了许多质疑。竞争性PCR 技术正好可解决上述问题。
竞争性PCR 是向样本中加入一个作为内标的竞争性模板，它与目的基因具有相同的引物结合位点，在扩增中两者的扩增效率基本相同，而且扩增片断在扩增后易于分离，然后依据内标的动力学曲线求得目的基因的原始拷贝数。竞争性PCR 技术已成功地应用于微囊藻中具有潜在产毒藻株的定量测定。在测定过程中，采用竞争性PCR 扩增技术和已标记过的特殊序列寡核苷酸探针技术联合的方法，使标记过的寡核苷酸探针与稳定的互补链杂交，最后进行比色测定。Rudi[33]等报道了利用该方法检测水样中产毒株、非产毒株和潜在产毒株，其检测限为100个细胞／mL 。竞争性PCR 技术的优点就是灵敏度高、检出限低、方法快捷。
3.2.3.2 实时定量PCR
实时定量PCR 技术是Holland 等在1991[34]年首先建立起来的分子生物学检测方法。该技术使用不可延伸的寡聚核苷酸杂交探针，利用DNA 聚合酶的5’端外切酶活性，从而检测PCR 产物。其探针的5’端设计了一个荧光染料报告集团[FAM (6 carboxy flurescein)]，3’端设计了一淬灭集团[TAMRA (6 carboxy tetramethyl rhodamine)]。当探针完整时，由于淬灭集团的作用，报告集团不能释放荧光。在PCR 循环的延伸阶段，由于DNA 聚合酶的5 端酶切活性切割杂交探针，使报告集团从探针中释放出来。利用报告集团荧光浓度与淬灭集团荧光浓度的比值，再通过软件记录、数据分析，从而进行定量测定。2002年Foulds[35]等利用该技术对微囊藻毒素的“合成酶操纵子mcyA 基因域”设计了mcyA 引物盒和探针，对产毒铜绿微囊藻进行检测，并用Brilliant 定量PCR 试剂盒来进行PCR 反应准备。在测定中，为了定量样品中开始的模板量，该样品在实时定量PCR 中沿着标准曲线进行反应，且标准曲线是通过基因组DNA 以10倍稀释梯度而产生的，故基因组DNA 浓度已知并确定来自于目的生物体。 该方法的具有许多优点，如在定量水中微生物方面速度较快，而且不需要用显微镜观察。Christian[36]等还证实实时定量PCR 具有很高的再现性。Martell[37]等发现实时定量PCR 的动力学范围达5个Log(103～107 )，标准曲线抑制系数平均为0.98；实验内部及不同实验间达到阈循环的变异系数分别为10％及6.2％ ；并且此技术全程闭管操作，没有PCR 的后处理过程，污染机率降低。由于其标准曲线的动力学范围广，为精确定量提供了较大的可信区间。
该方法自动化程度高、方便快捷能广泛应用。
4. 展望
作为水华微囊藻研究的第一步，水体中蓝藻的分离和鉴定一直是研究的一个重点，分离培养技术已经发展了很多年，已经形成了比较完整的体系。而对于微囊藻的鉴定还是刚刚起步的研究，尤其是在分子生物学（PCR ）领域。传统的藻类学鉴定方法是通过形态学的观察来划分的，这需要大量细致的工作，时间要求长。而且不同的种属差别很细微，非长期从事该工作的专业人员难胜任这项工作，并且藻的形态学观察的结果显示，环境对藻类的形态有很大的影响，鉴定出具体的种存在的困难较多，另外，要实现传统方法的鉴定，往往需要分离培养纯的藻株，根据生活史对其进行鉴定。分子鉴定的方法国际上已经被广泛地应用水华藻类的鉴定上，并且取得了许多很好的结果。如藻种的鉴定、产毒藻株的鉴别、水体生物演替等研究方面，但相比较而言，我国当前的研究则比较少。我国是一个平均可用水资源较少的国度，水体的安全尤为重要，因此有必要加强相关研究的投入，建立相应的研究网络，实现资源和信息共享，加大群众科学普及和参与力度。
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水华微囊藻分离及其鉴定技术研究进展
聂晶晶1 ，铁程2 ，金玉2，殷丽萍2，李元1 ，杨良 2
摘要：我国是蓝藻水华分布最广，受影响最大的国家之一。水华的普遍发生，使水体的感官性状恶化，水体自净能力降低。有毒蓝藻的研究也是目前热点之一；微囊藻毒素(Microcystins，MC) 是一种在蓝藻水华污染中出现频率最高、产生量最大和造成危害最严重的藻毒素种类。对其研究十分必要。但在微囊藻分离培养以及分离后纯种的鉴定研究方面还存在许多难点。本文介绍近几年来在水华蓝藻分离培养和鉴定技术方面的研究进展。
关键词：分子鉴定 蓝藻 水华 分离 培养
前言：湖泊、水库和河流中接纳过多的氮和磷等营养物质，使水体的生态结构与功能发生变化，导致藻类特别是蓝藻(Cyanobacteria)的异常繁殖生长而出现的蓝藻水华现象。当蓝藻水华严重时，水面形成厚厚的蓝绿色湖靛，散发出难闻的气味。不仅影响人的感官、破坏了健康平衡的水生生态系统，而且因藻细胞破裂后释放出了多种藻毒素而对人和动物的饮用水安全构成了严重的威胁。世界上25％～70％的蓝藻水华污染可产生藻毒素，在已发现的各种不同藻毒素中，微囊藻毒素(Microcystins，MC) 是一种在蓝藻水华污染中出现频率最高、产生量最大和造成危害最严重的藻毒素种类。纯种藻的分离和培养十分必要，然而藻类的分离培养有很多因素制约，如藻细胞普遍比较小，而且很多藻细胞聚集在一起也对分离造成了很多的困难。很多科研单位从藻种提供单位购买，不仅增加了研究支出，而且特异性的地区藻类的进化和遗传有很大差异。科研单位有必要独立解决藻类的分离培养技术。分离培养的纯种藻需要定性说明是什么藻，所以藻的鉴定也是十分必要的。
1. 藻类分离培养
藻类的分离方法就是为了提供纯种藻作为基础和应用研究的材料，也是今后开展藻类增长潜力试验(简称AGP 试验) 不可缺少的手段之一。藻类培养首先要有藻种。从天然水域的混杂生物群中，用一定方法把所需藻类个体分离出来，而获纯种培养。这种方法称为藻种分离和纯化，又称纯培养法。真正的“纯种培养”是指在排除包括细菌在内的一切生物的条件下进行的培养。这是进行科学研究不可缺少的技术，而在生产性培养中不排除细菌的称之为“单种培养”。要想从水体中分离出试验所需的纯种藻必须经预备培养；藻种分离；纯种培养；保种这四个步骤。
1.1 藻种分离
细胞藻类的分离方法按照培养载体分为：固体培养基法、液体培养基法。
1.1.1 固体培养基法
(1) 半固体稀释倒平板法：
先将待分离的材料用无菌水作一系列的稀释，然后分别取不同稀释液少许，与已溶化并冷却至35℃左右的琼脂培养基（200 mL培养基加入0.5g 琼脂）混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含藻的琼脂平板，保温培养一段时间后可出现菌落。如果稀释得当，在平板表面或者琼脂培养基中就可出现分散的单个藻种，然后挑取该单个藻株，或重复以上操作数次，便可得到纯的单种藻。
(2) 涂布平板法[1]：
由于将含藻材料先加到较热的培养基中再倒平板易造成某些热敏感的藻类死亡，而且采用稀
释倒平板法也会使一些 严格好氧的藻类被固定在琼脂中因缺乏氧气而影响生长，因此更常
用的纯种分离方法是涂布平板法。其做法是先将已溶的培养基倒入无菌培养皿中，冷却后将
一定量的某一稀释度的样品悬液滴在平板表面，再用无菌玻璃涂棒将藻液均匀分散至整个平
板表面；还有种做法是把稀释藻液装入消毒过的小型喷雾器中（如医用喉头喷雾器），打开
培养皿盖，把藻液喷射在培养基平面上，形成分布均匀的薄层水珠。经培养后挑取单个藻株。
(3) 平板划线分离法：
用接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料，以无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其
他形式的连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐渐分散开来，如果
划线适宜的话，微生物能一一分开，经培养后，可在平板表面得到单种。
1.1.2 液体培养基
对于有些藻类用固体培养基分离效果通常是满意的，但是有些藻类需要用液体培养基分
离来获得纯培养。培养微囊藻常用液体培养基有HGZ 、MA[2]、BG11等。单细胞藻类单种液
体培养基分离常用下列三种方法：微吸管分离法，水滴分离法，稀释分离法[3]。
(1) 微吸管分离法：
将稀释适度的藻滴水样，滴于凹玻片上。在显微镜下用微吸管挑选要分离的藻体， 认真仔
细地吸出放入另一个凹玻片上，在显微镜下观察该滴藻液中是否达到纯分离目的，如不成反
复几次，直至达到分离目的为止。然后移入经灭菌的培养液中(一般在20mL 试管中装入培养
液2～4mL) 进行培养。此法操作技术要求高，要细心。往往吸取一个细胞，要反复几次才能
成功。因为微囊藻个体较大，一般这种方法比较常用，但对操作者要求较高。
(2) 水滴分离法：
用微吸管吸取稀释适度的藻液，滴到消毒过的载玻片上，藻液水滴尽可能小些，要求在显徽
镜低倍镜视野中能看到水滴的全部或大部。一载玻片滴2滴，水滴作直线排列，互相间隔一
定距离，在显微镜下详细观察每一滴藻液。如果一滴藻液内只有一个或几个所需要分离的同
种藻类细胞，无其他生物混杂，即用吸管把这一滴藻液冲入装有培养液并经过灭菌的三角瓶
中， 如不成反复几次直至成功。水滴分离法简便易行，适宜于分离在培养液中占优势的藻
种。
(3) 稀释分离法：
把含有需要分离的藻类而又混杂有其他生物的水样，取其一定量，用培养液稀释。通过稀释
到适宜程度的方法，达到把原混杂生物单个分离培养的目的。首先把水样稀释到每一滴含有
一个左右的生物细胞，在稀释过程中配合显微镜检查，调节稀释度，然后准备装有1/4容量
培养液的试管20支，每一试管加入稀释适宜水样一滴，摇匀，进行培养。待藻类生长繁殖
达一定浓度时，再检查是否达到分离目的，若未达到，再重复做。此法操作简单易行，但有
一定程度盲目性，比不上水滴分离法效果。
纯种培养将毛细玻璃管吸取的单个藻体，用吸嘴吸入装有50mL 培养液的100 mL三角瓶中，
用灭菌纸封口放入培养架上进行培养。当藻增多长大后，用灭菌环取1滴藻液镜检，如果有
几种藻同时存在，要重新分离，直到分离出纯种藻体。在实际操作中，也可结合两个方法，
先固体培养基，优点是缩短培养周期，固体培养也容易挑取，再用液体培养基法，进一步纯
化。
2. 藻种培养
将确定为单种藻并且达到对数生长期的蓝藻移进l3号(112um)浮游植物网，用去离子水洗净
后，移到试管中，用50W 超声波处理30s ，将群体打碎，再按照上面的分离纯化方法进行
操作，直至得到无菌株。
2.1 保种
保种为了保证分离出来的单细胞藻种的成活，需定期将它移入新的培养液中，待藻种在新的
培养液中长成后， 便可将它放在低温、弱光下保存。保种时需要注意防止藻液污染。通常
用液体培养基保存藻种接种一次只能保存1～2个月，而用固体培养基保存藻种接种一次可
以保存半年到一年。保种用的固体培养基的营养物浓度应高于液体培养液，一般可增加一倍。
琼脂量为1％～1．5％, 而且现在对于藻类也可适当的减少琼脂量，使其制成半固体培养基，
实践中也获得不错的效果。
2.2 大量培养
微囊藻培养包括接种、培养、采收等。
（1）接种：一般要求选取生活力强、生长旺盛藻种。可先将浓缩藻种用连续稀释法，制备
一定浓度的悬浮藻液，然后接入培养容器。接种时注意藻种和培养液比例要适当，使藻细胞
在新培养液中达到一定数量。使一开始培养，藻类在培养液中占优势，另一方面还可缩短培
养周期，这是培养得到成功的经验之一。在环境条件不很适合情况下，更需提高接种量。一
般所用藻种浓度，根据藻类体积大小，每毫升30万～300万个，采用1∶2～1∶5的比例。
还需注意接种时间，在自然光条件下，最好在上午8～10时，不宜在晚上。
（2）培养管理：主要是使已接种培养物在相对稳定适宜环境中大量繁殖生长。要注意以下
因素：
1）二氧化碳浓度：在开放式不通气方法培养中，搅拌是十分必要的，可以增加水和空气的
接触面，使空气中二氧化碳溶解到培养液中，而且帮助沉淀藻类细胞上浮获得光照。在通气
培养中，培养液内应维持二氧化碳浓度在0.1～5％之间。
2）光照强度：利用太阳光源培养时，一般在室内培养可放在近窗口地方，防止强直射光照
射或利用人工光源（60～100Ｗ电灯或日光灯），需1500～3000Ix 。
3）温度：适温一般在10～30℃之间，最适温常为20～25℃。若在室外培养，夏季中午高
温，冬季早晚低温，常造成不利影响，需设法调节。
4）无机营养：应不断添加新鲜培养液，及时补充被藻吸收后减少了的某些元素。
5）注意pH 变化：变动过大，可用酸、碱调节。
6）适当控制培养物中藻细胞浓度：过高会引起光照和无机营养不足，并导致pH 上升。一
般控制在0.3g （干重）/L范围内。
7）及时观察和检查藻类生长情况：可以通过培养物呈现的颜色、藻类细胞运动情况、是否
有沉淀附壁、菌膜及敌害生物污染迹象等观察而了解一般的生长情况。藻种培养每半月进行
一次全面显微镜检查。大量培养中发现有不正常现象，应立即镜检，目的有两个：了解藻细
胞生长情况，并检查有无污染。
（3）采收：通常在培养物细胞浓度达到干重0.4～0.5克/升时，即可采收培养总量1/3的藻
体。采收时，先搅拌培养物，取出1/3量藻液，置于沉淀缸中，加入2％～3％明矾或6％饱
和石灰水。约1～2小时，藻细胞即可完全沉淀，取出沉淀，离心、浓缩、冻干。
3. 微囊藻鉴定方法
藻类在监测湖泊、水库等水体的水质状况时起着极其重要的作用，国内外已广泛应用藻类作
为生物监测、评价水质污染程度的重要指标。
3.1 物理方法
藻类识别统计的物理方法原理是根据不同类藻都有表明其身份的特征，如形态学上形态大
小、色素、色素体、贮藏物质等的差别来辨别不同种的藻类细胞，微囊藻的物理方法分辨主
要是根据形态上的空间布局和群体的构型不同。目前从传统的碘量法发展了很多种方法。
（1）离心沉降法[3]：
准确量取5O ～100mL 水样于离心管，4000 rpm 离心10min ，小心倒扣弃去上清液，用滤纸
吸去管口余水，向管内加入少量生理盐水，旋涡振荡洗下粘附在管壁的藻细胞，定容至1～
2mL ，计算浓缩倍数，用于下一步镜检。离心沉降法检测水中藻类数目与传统的碘液固定法
结果没有显著差异，并具有①快速检测(操作熟练者半小时可以出结果) ；②显微图像清晰(活
藻体，色素体等细胞结构没有破坏，易鉴定) ；③所需水样品量少(50～100mL) ；④不需用化
学药品等优点。
（2）显微彩色图像识别法[4]：
显微彩色图像处理在将制备的样本置于显微镜载标明藻类的种类和数量后，经1O0倍油镜
显微放大，通过CCD 摄像将获取的模拟图像信号输入图像采集卡中，并转换成Windows 位
图格式数字图像，保存在计算机中以备分析。在识别统计中，将待测样品的特征信息通过
CCD 摄像获得的模拟图象通过计算机终端转化信号，与计算机中的图象信息进行对比。
（3）免疫电镜技术识别：
大部分藻类都具有蛋白核(Pyrenoid)结构。最近国外研究资料认为蛋白核可能涉及光合功能
和CCM(CO2浓缩机制) ，Miyamura 等研究显示叶绿体DNA 位于蛋白核中。可见，蛋白核在
藻类叶绿体分子生物学、细胞生理及生物进化等方面都具有重要作用。为此，应用电镜技术
对几种藻类蛋白核超微结构进行了观察，应用对Rubisco 和Rubisco 活化酶进行分子定位。
利用制备的单克隆抗体和藻类表面抗原相结合的原理，可鉴别具有特定抗原的表面蛋白。利
用电子显微镜观察藻类细胞的微观结构来鉴定。还可以根据蛋白与特色染色剂进行特征染色
的特性，利用特定抗原的表面蛋白结合颜色的差异进行鉴别也是未来发展的方向。
3.2 分子生物学方法（PCR ）
传统的方法耗时长、劳动强度大、效率低，还存在着人为误差，非专业人员无法从事；并且
环境对藻类的形态有很大的影响，鉴定出具体的种存在的困难较多都此需要从分子上找出直
接的证据以鉴别。1985年由美国的莫里森发明了[1]PCR技术，该技术以其简便、快速、灵
敏、特异的特点，受到了分子生物学家的普遍重视。用于微囊藻毒株的鉴定和检测也是刚刚
兴起方法。
3.2.1 蛋白基因序列的测定鉴别微囊藻
编码蛋白的基因也可用来构建系统发生树，但由于这些基因存在的主要目的是其编码的蛋白
质在生物中所起的生理功能，因此只要蛋白质的组成或蛋白质的保守结构域不发生变化，他
们的就不会被淘汰。因此，功能性蛋白的基因能被用于进行更精细的藻种鉴定，在蓝藻中已
报道的几种用于分子鉴定的蛋白质基因包括藻蓝蛋白基因，DNA 依赖的RNA 聚合酶基因
ropCl ，和特定毒素合成有关的基因，和异形胞形成有关的基因。微囊藻的蛋白序列测定主
要是藻蛋白基因和微囊藻毒素合成基因。
3.2.1.1 藻蓝蛋白(PC)的序列测定
PC 是在蓝藻门，红藻门及隐藻门光合系统Ⅱ中天线色素分子之一[5]。其中蓝藻在淡水藻类
中是最常见的，蓝藻中整个PC 操纵子编码两个藻胆色素亚基β和a(分别定义为cpcB 和cpcA)
以及3个连接多肽[6]，cpcB 和cpcA 之间的基因间隔区(Intergenic Spacer，IGS) 是一个高变区，
不同种或株系的微囊藻在此段序列中会体现出不同程度的差异性，因此可用其对微囊藻种间
及种内以下关系加以区分[7-9]。利用PC 的IGS 序列的长度就能准确地预测来自水样中蓝藻
的属，PCR 产物的测序能区分不同的藻种[10]；Otsuka[11]等利用该技术研究了有毒和无毒微
囊藻之间的关系。他们检测了微囊藻的47个藻株的16S 到23S 核糖体DNA 内转录间隔序列。
结果表明，微囊藻可被划分为三群：第一藻群包括有毒和无毒藻株；第二群只有有毒藻株；
第三群只有无毒藻株。但用RAPD 扩增出现了多态性。所采用的藻蓝蛋白基因间隔序列(PC
—IGS) ，经证明是一个具有较高突变速率的区域，不同种或株系的微囊藻在此段序列中会体
现出不同程度的差异性，因此可用其对微囊藻种间及种以下关系加以区分。曾经报道过利用
PC 的IGS 序列能区分开巴西微囊藻的15个种[12]。我国学者钱开诚[13]等从PC —IGS 序列的差异性比较中可以看出该序列对于微囊藻而言有着较高的突变频率，适用于微囊藻种间的鉴定。这一点也可以从铜绿微囊藻与惠氏微囊藻的序列比对中得到证明(相似性仅为88.35％) ，这与Brett A．Neilan[14]等人的结论相符。
3.2.1.2 微囊藻毒素合成酶基因进行鉴别
1996年，Mei βner[15]等发现有毒和无毒微囊藻中都含有与已知的多肽合成酶基因同源的DNA 序列开始，到Tillett[16]等通过基因敲除和突变分析的方法报道了mcy 基因的全序列，这种产毒的微囊藻含有具同源性的肽合成酶基因保守序列，其中至少含有两个多肽合成酶基因，而微囊藻无毒株不具有这些基因。微囊藻毒素合成酶基因编码七个非核糖体肽链合成酶(NRPS)模块和聚乙酰合成酶(PKSs)，用来合成Adda 分子[17]。mcyA 、mcyB 、mcyC 编码NRPSs ；mcyE 、mcyG 编码NRPS —PKS ；mcyD 编码PKS ；mcyF 编码谷氨酸消旋酶，与微囊藻毒素分子中D —Glu 的合成有关[18]。人们针对微囊藻毒素合成酶基因中某一段基因设计特异性引物，在相应的反应体系中进行扩增，依据扩增出的相应片断进行定性分析。1999年Neilan[19]等直接从多肽合成酶和毒素合成酶基因中设计引物，来区分产毒和非产毒微囊藻。2001年Tillett[20]等为了调查微囊藻属是否产毒和种系发生之间的关系，曾专门针对微囊藻毒素合成酶基因mcyA 中的N 一甲基转移酶(NMT)域设计了一对PCR 引物(MSF和MSR) ，对35个微囊藻株进行实验研究。该实验结果显示：18个藻株存在NMT 域，并且在蛋白磷酸酶抑制试验中得出阳性结果；而其余17个无毒藻株均不存在NMT 域。2002年潘卉[21]等以国内水体中分离出的不同微囊藻藻株为研究对象，调查了mcyB 基因的分布情况，并利用PCR 技术鉴定毒性株。该次研究中建立的PCR 技术灵敏度高，可用来检测小于2000个藻细胞／mL 的水样是否存在mcyB 基因。
在这个研究领域，我国的研究人员开发出一种利用全细胞PCR 技术进行鉴别有毒微囊藻株系的方法，通过它不但可以快速准确地对实验室培养物进行鉴别，而且对自然水体中的微囊藻进行鉴别，因此对水体的安全评价有着重要的意义。班海群[22]等对西流湖水样进行全细胞PCR 扩增，PC —IGS 均呈阳性，mcyB 呈阳性结果，对mcyB 扩增产物克隆测序与Genbank 内的序列比对，测序结果与铜绿微囊藻的mcy 基因同源性大于97％ ，氨基酸同源性大于94％。司纪亮[23]等人利用对自然水体和实验室培养物进行的mcyD 的寡聚核苷酸引物参照引物mcyDF ，扩增mcyD 基因中的保守基元。对多株藻种进行了测序，通过对提取序列分析发现，mcyD 基因PCR 实验扩增结果与ELISA 检测结果相吻合，显示以mcyD 作为特殊的分子标志物检测水体中产微囊藻毒素和非产微囊藻毒素的蓝绿藻的方法是可行的。其序列一致性非常高，而不一致性极低，这显示目的基因保守程度极高，以这段序列设计的引物提高了检测结果的特异性、灵敏性。这种高度保守性可能与特殊的聚酮合成酶mcyD 负责微囊藻毒素中保守结构Adda 的合成有关mcyD 基因中的这个片段编码B-酮酰基合成酶和酰基转移酶功能域的一部分。翟超[24]等设计3对引物epF ／mblR ，mcF ／teR ，mcF ／umR ，通过全细胞PCR 的方法检测了l9种不同来源微囊藻产毒的情况，3种引物对l5株产毒微囊藻中均可扩增到预期大小的片段，测序结果证明这些片段是微囊藻毒素合成酶基因片段。张占会[25]等人也根据mcyB 的保守序列的特异性引物209F/409R 、27F1/409R 、MTR/MTF设计了三重全细胞PCR 方法可以同时产毒微囊藻和不产毒微囊藻，最小检出限为100个藻细胞／mL 。潘卉[26]等30株微囊藻藻株全细胞PCR 检测结果与常规PCR 、HPLC 、ELISA 、Bioassay 检测结果一致。检测下限低于100个藻细胞／mL 。
3.2.1.3 随机扩增的多态性DNA —PCR
Dittman[27，28]等从铜绿微囊藻HUB5—2—4中分离到一段称为mapepl 的DNA 片断，它能特异地与产毒微囊藻杂交，对这个片断的侧翼序列进行测序，发现其是由一个多肽合成酶基因家族组成；同时利用插入突变的方法敲断该基因发现它和微囊藻毒素的合成相关。因此，
在此基础上建立了一些检测产毒微囊藻的分子生物学方法。如随机引物扩增技术。
随机扩增的多态性DNA —PCR 技术是建立在常规PCR 技术基础之上的，利用随机的短脱氧核苷酸序列作为PCR 引物，对所研究的基因组DNA 进行PCR 扩增。扩增产物通过聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离，经EB 染色或放射自显影来检测扩增产物DNA 多态性。Nishihara 等对5种铜绿微囊藻进行分类研究，其结果与过去的同工酶分类相符，并找到一些种属特异条带[29]。RAPD —PCR 较常规PCR 反应更宜程序化[30]根据分子生物学原理研究，不难发现：RAPD —PCR 技术应用于微囊藻有毒与无毒株系的区分是基于微囊藻基因组的差别来进行的。利用短片段DNA 作为引物进行PCR 扩增，对于特定株系可以获得特定扩增条带组，据此准确的区分各个微囊藻的株系，并且结合原有的MC 的测定结果，可以快速地判定待测微囊藻是否产毒。该技术可用于水体中微囊藻的常规检测、年度间微囊藻组成的变化、水体中微囊藻株系分布等方面的研究[31]。2001年周晓明[32]等用微囊藻实验室建株的有毒和无毒株以及现场株系作RAPD 引物的扩增以及条带的对比，实验结果显示：三种株系微囊藻扩增的RAPD 引物各不相同，同种引物扩增出的条带也不相同，从而证明RAPD —PCR 技术可用于微囊藻的毒株快速分型。
3.2.3 其他方法
3.2.3.1 竞争性PCR 技术检测潜在产毒藻株
用核酸技术来进行环境监控的新方法虽然提供了较高的灵敏度和特异性，但对于它们的常规应用仍然存在一些局限性，例如在进行采样准备时通常是费力的，而且得出的复杂凝胶电泳条带也很难阐述。另外，由于环境样品的来源和质量有很大的变异性，所以使检测结果的可靠性产生了许多质疑。竞争性PCR 技术正好可解决上述问题。
竞争性PCR 是向样本中加入一个作为内标的竞争性模板，它与目的基因具有相同的引物结合位点，在扩增中两者的扩增效率基本相同，而且扩增片断在扩增后易于分离，然后依据内标的动力学曲线求得目的基因的原始拷贝数。竞争性PCR 技术已成功地应用于微囊藻中具有潜在产毒藻株的定量测定。在测定过程中，采用竞争性PCR 扩增技术和已标记过的特殊序列寡核苷酸探针技术联合的方法，使标记过的寡核苷酸探针与稳定的互补链杂交，最后进行比色测定。Rudi[33]等报道了利用该方法检测水样中产毒株、非产毒株和潜在产毒株，其检测限为100个细胞／mL 。竞争性PCR 技术的优点就是灵敏度高、检出限低、方法快捷。
3.2.3.2 实时定量PCR
实时定量PCR 技术是Holland 等在1991[34]年首先建立起来的分子生物学检测方法。该技术使用不可延伸的寡聚核苷酸杂交探针，利用DNA 聚合酶的5’端外切酶活性，从而检测PCR 产物。其探针的5’端设计了一个荧光染料报告集团[FAM (6 carboxy flurescein)]，3’端设计了一淬灭集团[TAMRA (6 carboxy tetramethyl rhodamine)]。当探针完整时，由于淬灭集团的作用，报告集团不能释放荧光。在PCR 循环的延伸阶段，由于DNA 聚合酶的5 端酶切活性切割杂交探针，使报告集团从探针中释放出来。利用报告集团荧光浓度与淬灭集团荧光浓度的比值，再通过软件记录、数据分析，从而进行定量测定。2002年Foulds[35]等利用该技术对微囊藻毒素的“合成酶操纵子mcyA 基因域”设计了mcyA 引物盒和探针，对产毒铜绿微囊藻进行检测，并用Brilliant 定量PCR 试剂盒来进行PCR 反应准备。在测定中，为了定量样品中开始的模板量，该样品在实时定量PCR 中沿着标准曲线进行反应，且标准曲线是通过基因组DNA 以10倍稀释梯度而产生的，故基因组DNA 浓度已知并确定来自于目的生物体。 该方法的具有许多优点，如在定量水中微生物方面速度较快，而且不需要用显微镜观察。Christian[36]等还证实实时定量PCR 具有很高的再现性。Martell[37]等发现实时定量PCR 的动力学范围达5个Log(103～107 )，标准曲线抑制系数平均为0.98；实验内部及不同实验间达到阈循环的变异系数分别为10％及6.2％ ；并且此技术全程闭管操作，没有PCR 的后处理过程，污染机率降低。由于其标准曲线的动力学范围广，为精确定量提供了较大的可信区间。
该方法自动化程度高、方便快捷能广泛应用。
4. 展望
作为水华微囊藻研究的第一步，水体中蓝藻的分离和鉴定一直是研究的一个重点，分离培养技术已经发展了很多年，已经形成了比较完整的体系。而对于微囊藻的鉴定还是刚刚起步的研究，尤其是在分子生物学（PCR ）领域。传统的藻类学鉴定方法是通过形态学的观察来划分的，这需要大量细致的工作，时间要求长。而且不同的种属差别很细微，非长期从事该工作的专业人员难胜任这项工作，并且藻的形态学观察的结果显示，环境对藻类的形态有很大的影响，鉴定出具体的种存在的困难较多，另外，要实现传统方法的鉴定，往往需要分离培养纯的藻株，根据生活史对其进行鉴定。分子鉴定的方法国际上已经被广泛地应用水华藻类的鉴定上，并且取得了许多很好的结果。如藻种的鉴定、产毒藻株的鉴别、水体生物演替等研究方面，但相比较而言，我国当前的研究则比较少。我国是一个平均可用水资源较少的国度，水体的安全尤为重要，因此有必要加强相关研究的投入，建立相应的研究网络，实现资源和信息共享，加大群众科学普及和参与力度。
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