荧光素酶研究进展

９８微生物学通报２００１年２８（５）

荧光素酶研究进展＋

张菊梅吴清平周小燕郭伟鹏吴慧清王元平

（广东省微生物研究所ｒ．州５１０昕０）

摘要：荧光素酶（Ｌｕｃｉ＆Ｉｒ且ｓｅ）可以分为萤业虫荧光索酶和细菌荧光素酶两太娄。萤火虫

荧光素酶是分子量为６０—６４ｋＤ的多肽链，在＾ｆ矿＋、Ａ口、０２存在时．催化Ｄ一荧光素（Ｄ・

Ｌｕｃ如订ｎ）氧化脱援，发出光（ｘ＝５５０一５８０ｎｍ）。细菌荧光索酶足含ｎ、口两个多肽亚基的加

单氧酶．它催化长链脂肪醛、ＦＭＮ巩和０２的氧化反应，发出绿蓝光（＾＝４９０ｎｍ）。萤火虫

荧光素酶和细菌荧光素酶可分别从萤火虫和发光细菌中直接提前．亦可用基因工程的方法

进行生产。荧光紊酶催化的发光反应能用生物发光检测仪进行灵敏、快速检测，因此该酶

有多方面的用途．如应用于快速榆测、报告基因分析、有毒有害物质分析等。

关键词：萤火虫荧光素酶．细菌荧光索酶．生物发光

中圈分类号：０５５４文献标识码：Ａ文章编号：０２５３．２６５４（２００１）０５－００９８－０４

荧光素酶（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）是生物体内催化荧光素或脂肪醛氧化发光的一类酶的总称。

自然界有许多发光生物，１９５６年，ＭｃＥｌｍｙ等首次从萤火虫中提取到荧光素酶，此后各

国研究人员相继报道了对各种发光生物中荧光素酶的研究。由于荧光素酶检测简便、

灵敏、快速，因此目前荧光素酶基因在基因工程方面已成为广泛使用的报告基因，同

时荧光素酶在发光免疫分析及环境监测、微生物检测等方面的应用正愈来愈受到关注。

ｌ荧光素酶的种类

自然界中具有发光能力的生物种类很多，常见的主要有：发光蘑菇（Ｌｕ血ｎｏｕｓ

ｍｌｌｓｈｒｏｏｍ）、发光蚯蚓（ＬｕＩＩｌｉｎｏｕｓｅａｒｔｌｌｗ０Ⅱｍ、发光细菌（Ｌｕ商ｎｏｕｓｂａｃｔｅ血）、发光水母

（ｈ“ｎｏｌｌｓｉｅｌｌ面幽）、发光甲虫（ｈｌ面ｎｏｕｓｂｅ甜ｅｓ，它们主要由萤火虫（６棚ｉｅｓ），叩头虫

（ｃＨｃｋｂｅｅｄｅｓ）和欧洲萤（丑ｏｗｗｏｎｎｓ）３大种类组成）。目前，除发光蘑菇和发光蚯蚓的

发光机理尚不清楚外，其余生物的发光机理已研究得较为透彻，并使细菌荧光素酶

（Ｂａｃｔｅ＾ａｌｈｌｃ如瑚ｅ简称ＢＬ）和萤火虫荧光素酶（Ｆ；ｒｅｎｖＬｎｃｉｆｅｒａｓｅ简称ＦＬ）形成商品酶

ｃⅢｃｉ口ｆｄ）０２１及东欧萤火虫用于分析检测。北美萤火虫（№“ｎ淞刀ｍ如）…，日本萤火虫（厶圮ｆＤｋ

（Ｌ．棚增坤“∞）可产生ＦＬ。夏威夷弧菌（ｖｆ扫一Ｄｋ嗍ｊ）、费氏弧菌（ｙ．Ｊｂｃｈ￡一）、明

３和发光致病杆菌（‰ｎＤｍ批ｓ概出ｆ）等陆生发光细菌¨１可产生ＢＬ。细菌＿３亮发光杆菌（ＰｈｏｆＤ妇ｍ—Ｍｍｐ＾唧肋肥Ⅱｍ）及鳆发光杆菌（Ｐ．ｆＰｉ船舶删）等海洋发光ｍｍｆｎＰ，卵ｎ，）、羽田希瓦氏菌（Ａ加阳舢Ｍｓ

２荧光素酶的性质和结构

２．１萤火虫荧光素酶的性质和结构ＦＬ在Ｍ孑＋、Ａ７ｒＰ、ｏｚ存在时，催化Ｄ．荧光素（Ｄ—

Ｌｍｃｊｆｅｉｎ）氧化脱羧，同时发出可见光，不同种之间发射波长略有不同（５５０～５８０ｎｍ）．

＊广东省自然科学基金资助项目（Ｎｏ９８０８８１）

２＿２０收藕日期：２０００．０８—２０．謦回日期：ａ∞０－１

２００１年２８（５）微生物学通报

其反应式为：

Ｌｍｉｈｊｎ＋＾ＴＰ＋０２—旦ｏｘｙｌ№＆ｍ＾ＭＰ＋ｐｐｌ＋Ｈｚｏ＋ｈ““““”＋０２ｉｊ－“ｙ１”“…“９＋ｐＰ””ｚｏ＋“”

２ｕＦＬ的分子量约６０．６４ｋＤ，从日本萤火虫（Ｌ．ｃ刚ｃ妇ｍ）中提取的ＦＬ含５４８个氨基酸，分子量约６ｌｋＤｌｏ；北美萤火虫（尸．刑ｍ胁）的ＦＬ则含５５０个氨基酸，分子量约

６２ｋ∥１１；东欧萤火虫（Ｌ．ｍｍ旦理ｆ油）的ＦＬ与日本萤火虫ＦＬ相似。日本萤火虫ＦＬ与

北美萤火虫Ｆ１Ｊ氨基酸序列６７％同源［２Ｉ。有研究表明，ＦＬ的Ｎ端１６个氨基酸与催化活

性密切相关…。

ＦＬ是蛋白质和脂类复合物（磷脂和中性脂质与ＦＬ结合），在去氧胆酸钠中能使酶

活性迅速减弱，Ｍ一＋与ＦＬ结合能提高酶的活性；磷酸脂是特定的酶激活剂，能稳定

ＦＬ，不致失活，而长链胆碱衍生物（ｃ１２～ｃ１Ｂ）能使ＦＬ快速、不可逆地失活；牛血清白

蛋白、氮基乙醇、ｃｏＡ能显著提高ＦＬ的活性，并促进光的产生１５Ｊ。随着反应体系ｐＨ

的降低，产生的光波长增加；如果各种反应底物成过量状态，则发射光强度与反应体

系中ＦＬ的量成正比。

２．２细菌荧光素酶的性质和结构ＢＬ催化长链脂肪醛、ＦＭＮＨ２和０２的氧化反应，发出

绿蓝光（ｘ＝４９０ｎｍ），反应式可表示如下：

ＢＬＦＭ川也＋ＲＣＨＯ＋吼一ｎｄＮ＋Ｒｃ００Ｈ＋Ｈ２０＋ｈ”

ＢＬ是杂二聚体，含ａ、Ｂ两个多肽亚基的加单氧酶。单独ａ、ｐ亚基均无发光活性，

只有ａ、Ｂ共存时才有活性。从不同海洋细菌中提取到的ＢＬ其分子量基本相同，其中＊

亚基台３５４个氨基酸，分子量约如ｋＤ，Ｂ．亚基含３２５个氨基酸，分子量约３７ｋＤ。从陆

生细菌中分离到的ＢＬ的ｍ亚基含３６０个氨基酸，分子量约４１ｋＤ，Ｂ一亚基含３２７个氨基

酸．分子量约３８ｋＤ，其中陆生细菌的廿亚基和Ｇ．亚基氨基酸序列分别有８５％和６０％与

海洋细菌同源ｆ３’４ｊ。有研究表明，ＢＬ与黄素（ｎａｖｉｎ）结合点在ａ．亚基；通过基因重组

及定位点诱变发现”亚基控制酶的催化能力和结构特点，亦是评判酶的热稳定性的关

键因素；。．１１３位对酶与黄素的相互作用密切相关，＊２２７位在调整酶与底物醛的作用中

处于中心位置ｏｏ。

和其它酶一样，ＢＬ活性受许多因素的影响：０２和离子浓度均能影响发光，Ｈ２０２、

乙醛及长链烷基化合物在反应中刺激发光。从发光致病杆菌（ｘ．加耐ｎｅｊｃｍｓ）中提取

的ＢＬ发现．酶与ＦＭＮ和豆蔻酸（十四烷酸）形成三元络合物，三元络台物的慢分解

限制了酶的转换，脂肪酸能促进酶与ＦＭＮ的相互作用”Ｊ。研究热稳定性发现，ＢＬ的热

稳定性与其所表达的有机体有关，但与有机体细胞的抗热性无关，木糖醇ｊ甘油加入

培养基中保护酶的活性［７Ｉ。Ｎ．乙基顺丁烯二酰亚胺对ＢＬ失活的影响与ｐＨ有关，随缓

冲溶液浓度的增大，失活率升高。

３荧光素酶的制备

作为ＦＬ生产原料的萤火虫，要依靠人工捕捉或养殖，受地域和季节性限制，且该

生物生产周期长、养殖成本高、提取的酶成分复杂，随着分子生物学的发展，人们转

向用基因工程的方法进行生产。１９８５年，ｄｅｗｅｔ，Ｊ．Ｒ．等首次克隆了．Ｐ．目州胁的

兀．基因。并在大肠杆菌（西ｃｋ一曲缸∞ｆｆ）中表达．从中得到具有活性的ＦＬＬ…。１９８６年，他们测定了ＦＬ基因的ｃＤＮＡ序列。随后，各种发光甲虫的Ｆ１Ｊ基因相继克隆成功，

１００微生物学通报２００１年２８（５）

并能在原核和真核表达系统中表达。取自尸．一ｍ船长约１．８ｋｂ的ｃＤＮＡ基因在Ｅ

ｃ口ｆｉ表达的产物是分子量为６２ｋＤ，含５５０个氨基酸的多肽链，与自然提取得到的凡相

比，具有同样的反应动力学特性和发射波长，在相同的反应条件下酶的稳定性亦无差

异１８Ｊ。萤火虫荧光素酶基因通过克隆在Ｅ．ｃｏｆｆ表达，转化体在３７℃、ＬＢ培养基中生

长到对数后期收集菌体，用渗透压法、冻融法提取细菌胞质组分，经均质、离心，用

凝胶排阻、离子交换色谱提取纯酶，冷冻干燥保存”。

ＢＬ可从培养发光细菌直接提取得到，其制备方法与ＦＬ类似。从ｖ加删ｆ中提

取的酶括可达１．８×ｌＯ“ＬＵ／ｎ峨，为获得特殊用途的ＢＬ．亦可通过诱变或基因克隆得到。

各种发光细菌的基因克隆均有许多报道【１“。

４荧光素酶的测定

荧光素酶的测定可以采用多种不同的体系，常用的ＦＬ酶活测定系统为：１０“Ｌ酶溶

液，４００止２５ｍｍ０Ｌ／Ｌｇｌ”ｙ１９１巾ｎｅ（ｐＨ７．８），５．４ｍｍｏＬ／ＬＭ茚０４，Ｏ．０８６ｌ姗ｏｌ／ＬＤ—ｈｃｉ岛＾ｎ，

反应以加入８０ｎＬｌＯｍｍｏｌ／ＬＡＴＰ开始，用液闪仪或生物发光测定仪（Ｌｕｎｌｉｎｏｍｅｔｅｒ）测定

发光强度”“，测定温度为２５℃。

常用的ＢＬ测定系统包括：１０汕酶溶液，１８０止５０ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸缓冲液（ｐＨ７．Ｏ），

１０止十四醛饱和液（以缓冲液溶解），测定温度为２５℃，反应从加入１００汕２５ⅢＬ／Ｌ

ＦＭＮＨ２开始，用生物发光测定仪测定光的强度－ｌ…。

在反应体系中，生物发光随反应时间的延长其发光不断减弱，开始的１１１ｌｉｎ内，发

光脉冲计数值下降最快，以后随时问下降速度不断减缓，因此，反应体系混合后应尽

快测定，才能取得较准确的发光脉冲计数值。

５荧光素酶的应用

５．１快速检测ＡＴＰ既是ＦＬ催化发光的必需底物，又是所有生物生命活动的能量来源，

传统的测定方法操作复杂，灵敏度低，缺乏足够的专一性。在ＦＬ催化的发光反应中，

ＡＴＰ在一定的浓度范围内，其浓度与发光强度呈线形关系，因此，测定ＡＴＰ具有快速

灵敏的特点，自１９４７年ＭｃＥｈｏｖ等首次应用ＦＬ测定ＡＴＰ以来，荧光素酶在生物化学及

生物技术的分析应用不断发展，其检测和研究范围包括：临床医学及法医学检测；生

命科学研究；环境监测和制备广谱酶联免疫检测试剂。

利用ＢＬ催化的发光特性可用来检测特异性细菌如大肠杆菌、李斯特菌等，其原理

是带有ＢＬ基因ｋ的噬菌体攻击特异性细菌，将Ｌ一带入宿主细胞，荧光发射只出现

在被噬菌体感染的细胞，并与之数量相对应，利用这种方法检测污染食品中的李斯特

菌可从传统的分离、培养、鉴定至少９６ｈ缩短至２４ｈ，甚至将检测限降至１ｃｅｌｌ／ｇ，该方

法简单、快速、灵敏，容易掌握【ｌ“。

５．２报告基因分析早在１９８８年就有报道在分子生物学中应用荧光素酶基因作报告基

因【ｌ…。通过测定荧光素酶基因的表达，监测各种启动子（ｐｍｍｏｔｅｒ）的活性；利用荧光

素酶基因与特定目的基因的连锁或共转移，可以建立非放射性的外源基因检测体系。

目前，这一技术在全世界得到了广泛应用，现代检测仪器甚至可以检测到１０“９ｒｎｏＩ的

酶量，比检测氯霉素乙酰转移酶（ｃＡＴ）灵敏１００—１０００倍。由于荧光素酶酶活检测比ｃＡＴ检测快速、方便、灵敏、经济，而且可以进行活细胞直接检测，因此在分子生物

２００１年２８（５）微生物学通报１０１

学研究中可用荧光素酶表达检测代替ｃＡＴ检测。

５．３有毒有害物质分析１９９４年，ｚｏｍｅｒ等报道了应用荧光素酶催化的生物发光现象进行

水、土壤、食品等样品中有机磷和氨基甲酸酯等杀虫剂的灵敏检测Ｌ１４：。其原理是昆虫

脑提取物中有杀虫剂攻击的受体或酶结合位点，将生物发光的底物——Ｄ．Ｌｕｃｉｆｅｄｎ衍生

物渗透至昆虫脑提取物中，昆虫脑提取物能将Ｄ—Ｌｕｃｉｆｅｄｎ衍生物水解为Ｄ．ｈｃｉｆｅ＾ｎ，添

加ＡＴＰ和｝’Ｌ，即可发生生物发光，而杀虫剂能抑制这种水解括性，通过检测发光强度，

即可计算杀虫剂的浓度，灵敏度可达５０“∥Ｌ。

人们对生物发光的研究由来已久，通过基因重组及细胞融合技术，获得能满足各

种用途的酶，如定位点诱变提高其耐热性，改变发射光波长等。由于荧光素酶来源有

限，价格昂贵，同时在溶液中是不稳定的，使它的应用受到很大限制，为了降低分析

测试成本，扩大其应用范围，实现测定的自动化、连续化，Ｄｅｌｕｃａ’ｓ等在１９７６年首次成

功的用化学方法固定化ＦＬ和ＢＬ，以后相继有多人采用了多种固定化方法，最近Ｉ．ｕｎ．

ｄｏｖｓｋｉｋｈ，ＩＡ．等应用ＢｒＣＮ活化的ＳｅＤｈａｍｓｅ固定化重组的ＦＬ，使检测更稳定，ＡＴＰ

检测范围为ｏ．ｏｌ～ｌＯ，０００ｎｍ０Ｊ／Ｌ水平…Ｊ。随者固定化膜技术及生物传感器的发展，荧

光素酶的应用范围将更宽广。

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ｉ为执行国务院发布的《关于在我国统一实行法定计量单位的命令》规定，根据中华人民共睾

｝和国国家标准（ＧＢ３ｌ∞～３１０２—９３）《量和单位》一书所述内容，现将车刊常用的计量单位符号睾

ｉ介绍如下，希广大作者参照执行。

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荧光素酶研究进展

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被引用次数：张菊梅， 吴清平， 周小燕， 郭伟鹏， 吴慧清， 王元平广东省微生物研究所微生物学通报MICROBIOLOGY2001,28(5)15次

参考文献(15条)

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本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_wswxtb200105024.aspx

９８微生物学通报２００１年２８（５）

荧光素酶研究进展＋

张菊梅吴清平周小燕郭伟鹏吴慧清王元平

（广东省微生物研究所ｒ．州５１０昕０）

摘要：荧光素酶（Ｌｕｃｉ＆Ｉｒ且ｓｅ）可以分为萤业虫荧光索酶和细菌荧光素酶两太娄。萤火虫

荧光素酶是分子量为６０—６４ｋＤ的多肽链，在＾ｆ矿＋、Ａ口、０２存在时．催化Ｄ一荧光素（Ｄ・

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单氧酶．它催化长链脂肪醛、ＦＭＮ巩和０２的氧化反应，发出绿蓝光（＾＝４９０ｎｍ）。萤火虫

荧光素酶和细菌荧光素酶可分别从萤火虫和发光细菌中直接提前．亦可用基因工程的方法

进行生产。荧光紊酶催化的发光反应能用生物发光检测仪进行灵敏、快速检测，因此该酶

有多方面的用途．如应用于快速榆测、报告基因分析、有毒有害物质分析等。

关键词：萤火虫荧光素酶．细菌荧光索酶．生物发光

中圈分类号：０５５４文献标识码：Ａ文章编号：０２５３．２６５４（２００１）０５－００９８－０４

荧光素酶（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）是生物体内催化荧光素或脂肪醛氧化发光的一类酶的总称。

自然界有许多发光生物，１９５６年，ＭｃＥｌｍｙ等首次从萤火虫中提取到荧光素酶，此后各

国研究人员相继报道了对各种发光生物中荧光素酶的研究。由于荧光素酶检测简便、

灵敏、快速，因此目前荧光素酶基因在基因工程方面已成为广泛使用的报告基因，同

时荧光素酶在发光免疫分析及环境监测、微生物检测等方面的应用正愈来愈受到关注。

ｌ荧光素酶的种类

自然界中具有发光能力的生物种类很多，常见的主要有：发光蘑菇（Ｌｕ血ｎｏｕｓ

ｍｌｌｓｈｒｏｏｍ）、发光蚯蚓（ＬｕＩＩｌｉｎｏｕｓｅａｒｔｌｌｗ０Ⅱｍ、发光细菌（Ｌｕ商ｎｏｕｓｂａｃｔｅ血）、发光水母

（ｈ“ｎｏｌｌｓｉｅｌｌ面幽）、发光甲虫（ｈｌ面ｎｏｕｓｂｅ甜ｅｓ，它们主要由萤火虫（６棚ｉｅｓ），叩头虫

（ｃＨｃｋｂｅｅｄｅｓ）和欧洲萤（丑ｏｗｗｏｎｎｓ）３大种类组成）。目前，除发光蘑菇和发光蚯蚓的

发光机理尚不清楚外，其余生物的发光机理已研究得较为透彻，并使细菌荧光素酶

（Ｂａｃｔｅ＾ａｌｈｌｃ如瑚ｅ简称ＢＬ）和萤火虫荧光素酶（Ｆ；ｒｅｎｖＬｎｃｉｆｅｒａｓｅ简称ＦＬ）形成商品酶

ｃⅢｃｉ口ｆｄ）０２１及东欧萤火虫用于分析检测。北美萤火虫（№“ｎ淞刀ｍ如）…，日本萤火虫（厶圮ｆＤｋ

（Ｌ．棚增坤“∞）可产生ＦＬ。夏威夷弧菌（ｖｆ扫一Ｄｋ嗍ｊ）、费氏弧菌（ｙ．Ｊｂｃｈ￡一）、明

３和发光致病杆菌（‰ｎＤｍ批ｓ概出ｆ）等陆生发光细菌¨１可产生ＢＬ。细菌＿３亮发光杆菌（ＰｈｏｆＤ妇ｍ—Ｍｍｐ＾唧肋肥Ⅱｍ）及鳆发光杆菌（Ｐ．ｆＰｉ船舶删）等海洋发光ｍｍｆｎＰ，卵ｎ，）、羽田希瓦氏菌（Ａ加阳舢Ｍｓ

２荧光素酶的性质和结构

２．１萤火虫荧光素酶的性质和结构ＦＬ在Ｍ孑＋、Ａ７ｒＰ、ｏｚ存在时，催化Ｄ．荧光素（Ｄ—

Ｌｍｃｊｆｅｉｎ）氧化脱羧，同时发出可见光，不同种之间发射波长略有不同（５５０～５８０ｎｍ）．

＊广东省自然科学基金资助项目（Ｎｏ９８０８８１）

２＿２０收藕日期：２０００．０８—２０．謦回日期：ａ∞０－１

２００１年２８（５）微生物学通报

其反应式为：

Ｌｍｉｈｊｎ＋＾ＴＰ＋０２—旦ｏｘｙｌ№＆ｍ＾ＭＰ＋ｐｐｌ＋Ｈｚｏ＋ｈ““““”＋０２ｉｊ－“ｙ１”“…“９＋ｐＰ””ｚｏ＋“”

２ｕＦＬ的分子量约６０．６４ｋＤ，从日本萤火虫（Ｌ．ｃ刚ｃ妇ｍ）中提取的ＦＬ含５４８个氨基酸，分子量约６ｌｋＤｌｏ；北美萤火虫（尸．刑ｍ胁）的ＦＬ则含５５０个氨基酸，分子量约

６２ｋ∥１１；东欧萤火虫（Ｌ．ｍｍ旦理ｆ油）的ＦＬ与日本萤火虫ＦＬ相似。日本萤火虫ＦＬ与

北美萤火虫Ｆ１Ｊ氨基酸序列６７％同源［２Ｉ。有研究表明，ＦＬ的Ｎ端１６个氨基酸与催化活

性密切相关…。

ＦＬ是蛋白质和脂类复合物（磷脂和中性脂质与ＦＬ结合），在去氧胆酸钠中能使酶

活性迅速减弱，Ｍ一＋与ＦＬ结合能提高酶的活性；磷酸脂是特定的酶激活剂，能稳定

ＦＬ，不致失活，而长链胆碱衍生物（ｃ１２～ｃ１Ｂ）能使ＦＬ快速、不可逆地失活；牛血清白

蛋白、氮基乙醇、ｃｏＡ能显著提高ＦＬ的活性，并促进光的产生１５Ｊ。随着反应体系ｐＨ

的降低，产生的光波长增加；如果各种反应底物成过量状态，则发射光强度与反应体

系中ＦＬ的量成正比。

２．２细菌荧光素酶的性质和结构ＢＬ催化长链脂肪醛、ＦＭＮＨ２和０２的氧化反应，发出

绿蓝光（ｘ＝４９０ｎｍ），反应式可表示如下：

ＢＬＦＭ川也＋ＲＣＨＯ＋吼一ｎｄＮ＋Ｒｃ００Ｈ＋Ｈ２０＋ｈ”

ＢＬ是杂二聚体，含ａ、Ｂ两个多肽亚基的加单氧酶。单独ａ、ｐ亚基均无发光活性，

只有ａ、Ｂ共存时才有活性。从不同海洋细菌中提取到的ＢＬ其分子量基本相同，其中＊

亚基台３５４个氨基酸，分子量约如ｋＤ，Ｂ．亚基含３２５个氨基酸，分子量约３７ｋＤ。从陆

生细菌中分离到的ＢＬ的ｍ亚基含３６０个氨基酸，分子量约４１ｋＤ，Ｂ一亚基含３２７个氨基

酸．分子量约３８ｋＤ，其中陆生细菌的廿亚基和Ｇ．亚基氨基酸序列分别有８５％和６０％与

海洋细菌同源ｆ３’４ｊ。有研究表明，ＢＬ与黄素（ｎａｖｉｎ）结合点在ａ．亚基；通过基因重组

及定位点诱变发现”亚基控制酶的催化能力和结构特点，亦是评判酶的热稳定性的关

键因素；。．１１３位对酶与黄素的相互作用密切相关，＊２２７位在调整酶与底物醛的作用中

处于中心位置ｏｏ。

和其它酶一样，ＢＬ活性受许多因素的影响：０２和离子浓度均能影响发光，Ｈ２０２、

乙醛及长链烷基化合物在反应中刺激发光。从发光致病杆菌（ｘ．加耐ｎｅｊｃｍｓ）中提取

的ＢＬ发现．酶与ＦＭＮ和豆蔻酸（十四烷酸）形成三元络合物，三元络台物的慢分解

限制了酶的转换，脂肪酸能促进酶与ＦＭＮ的相互作用”Ｊ。研究热稳定性发现，ＢＬ的热

稳定性与其所表达的有机体有关，但与有机体细胞的抗热性无关，木糖醇ｊ甘油加入

培养基中保护酶的活性［７Ｉ。Ｎ．乙基顺丁烯二酰亚胺对ＢＬ失活的影响与ｐＨ有关，随缓

冲溶液浓度的增大，失活率升高。

３荧光素酶的制备

作为ＦＬ生产原料的萤火虫，要依靠人工捕捉或养殖，受地域和季节性限制，且该

生物生产周期长、养殖成本高、提取的酶成分复杂，随着分子生物学的发展，人们转

向用基因工程的方法进行生产。１９８５年，ｄｅｗｅｔ，Ｊ．Ｒ．等首次克隆了．Ｐ．目州胁的

兀．基因。并在大肠杆菌（西ｃｋ一曲缸∞ｆｆ）中表达．从中得到具有活性的ＦＬＬ…。１９８６年，他们测定了ＦＬ基因的ｃＤＮＡ序列。随后，各种发光甲虫的Ｆ１Ｊ基因相继克隆成功，

１００微生物学通报２００１年２８（５）

并能在原核和真核表达系统中表达。取自尸．一ｍ船长约１．８ｋｂ的ｃＤＮＡ基因在Ｅ

ｃ口ｆｉ表达的产物是分子量为６２ｋＤ，含５５０个氨基酸的多肽链，与自然提取得到的凡相

比，具有同样的反应动力学特性和发射波长，在相同的反应条件下酶的稳定性亦无差

异１８Ｊ。萤火虫荧光素酶基因通过克隆在Ｅ．ｃｏｆｆ表达，转化体在３７℃、ＬＢ培养基中生

长到对数后期收集菌体，用渗透压法、冻融法提取细菌胞质组分，经均质、离心，用

凝胶排阻、离子交换色谱提取纯酶，冷冻干燥保存”。

ＢＬ可从培养发光细菌直接提取得到，其制备方法与ＦＬ类似。从ｖ加删ｆ中提

取的酶括可达１．８×ｌＯ“ＬＵ／ｎ峨，为获得特殊用途的ＢＬ．亦可通过诱变或基因克隆得到。

各种发光细菌的基因克隆均有许多报道【１“。

４荧光素酶的测定

荧光素酶的测定可以采用多种不同的体系，常用的ＦＬ酶活测定系统为：１０“Ｌ酶溶

液，４００止２５ｍｍ０Ｌ／Ｌｇｌ”ｙ１９１巾ｎｅ（ｐＨ７．８），５．４ｍｍｏＬ／ＬＭ茚０４，Ｏ．０８６ｌ姗ｏｌ／ＬＤ—ｈｃｉ岛＾ｎ，

反应以加入８０ｎＬｌＯｍｍｏｌ／ＬＡＴＰ开始，用液闪仪或生物发光测定仪（Ｌｕｎｌｉｎｏｍｅｔｅｒ）测定

发光强度”“，测定温度为２５℃。

常用的ＢＬ测定系统包括：１０汕酶溶液，１８０止５０ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸缓冲液（ｐＨ７．Ｏ），

１０止十四醛饱和液（以缓冲液溶解），测定温度为２５℃，反应从加入１００汕２５ⅢＬ／Ｌ

ＦＭＮＨ２开始，用生物发光测定仪测定光的强度－ｌ…。

在反应体系中，生物发光随反应时间的延长其发光不断减弱，开始的１１１ｌｉｎ内，发

光脉冲计数值下降最快，以后随时问下降速度不断减缓，因此，反应体系混合后应尽

快测定，才能取得较准确的发光脉冲计数值。

５荧光素酶的应用

５．１快速检测ＡＴＰ既是ＦＬ催化发光的必需底物，又是所有生物生命活动的能量来源，

传统的测定方法操作复杂，灵敏度低，缺乏足够的专一性。在ＦＬ催化的发光反应中，

ＡＴＰ在一定的浓度范围内，其浓度与发光强度呈线形关系，因此，测定ＡＴＰ具有快速

灵敏的特点，自１９４７年ＭｃＥｈｏｖ等首次应用ＦＬ测定ＡＴＰ以来，荧光素酶在生物化学及

生物技术的分析应用不断发展，其检测和研究范围包括：临床医学及法医学检测；生

命科学研究；环境监测和制备广谱酶联免疫检测试剂。

利用ＢＬ催化的发光特性可用来检测特异性细菌如大肠杆菌、李斯特菌等，其原理

是带有ＢＬ基因ｋ的噬菌体攻击特异性细菌，将Ｌ一带入宿主细胞，荧光发射只出现

在被噬菌体感染的细胞，并与之数量相对应，利用这种方法检测污染食品中的李斯特

菌可从传统的分离、培养、鉴定至少９６ｈ缩短至２４ｈ，甚至将检测限降至１ｃｅｌｌ／ｇ，该方

法简单、快速、灵敏，容易掌握【ｌ“。

５．２报告基因分析早在１９８８年就有报道在分子生物学中应用荧光素酶基因作报告基

因【ｌ…。通过测定荧光素酶基因的表达，监测各种启动子（ｐｍｍｏｔｅｒ）的活性；利用荧光

素酶基因与特定目的基因的连锁或共转移，可以建立非放射性的外源基因检测体系。

目前，这一技术在全世界得到了广泛应用，现代检测仪器甚至可以检测到１０“９ｒｎｏＩ的

酶量，比检测氯霉素乙酰转移酶（ｃＡＴ）灵敏１００—１０００倍。由于荧光素酶酶活检测比ｃＡＴ检测快速、方便、灵敏、经济，而且可以进行活细胞直接检测，因此在分子生物

２００１年２８（５）微生物学通报１０１

学研究中可用荧光素酶表达检测代替ｃＡＴ检测。

５．３有毒有害物质分析１９９４年，ｚｏｍｅｒ等报道了应用荧光素酶催化的生物发光现象进行

水、土壤、食品等样品中有机磷和氨基甲酸酯等杀虫剂的灵敏检测Ｌ１４：。其原理是昆虫

脑提取物中有杀虫剂攻击的受体或酶结合位点，将生物发光的底物——Ｄ．Ｌｕｃｉｆｅｄｎ衍生

物渗透至昆虫脑提取物中，昆虫脑提取物能将Ｄ—Ｌｕｃｉｆｅｄｎ衍生物水解为Ｄ．ｈｃｉｆｅ＾ｎ，添

加ＡＴＰ和｝’Ｌ，即可发生生物发光，而杀虫剂能抑制这种水解括性，通过检测发光强度，

即可计算杀虫剂的浓度，灵敏度可达５０“∥Ｌ。

人们对生物发光的研究由来已久，通过基因重组及细胞融合技术，获得能满足各

种用途的酶，如定位点诱变提高其耐热性，改变发射光波长等。由于荧光素酶来源有

限，价格昂贵，同时在溶液中是不稳定的，使它的应用受到很大限制，为了降低分析

测试成本，扩大其应用范围，实现测定的自动化、连续化，Ｄｅｌｕｃａ’ｓ等在１９７６年首次成

功的用化学方法固定化ＦＬ和ＢＬ，以后相继有多人采用了多种固定化方法，最近Ｉ．ｕｎ．

ｄｏｖｓｋｉｋｈ，ＩＡ．等应用ＢｒＣＮ活化的ＳｅＤｈａｍｓｅ固定化重组的ＦＬ，使检测更稳定，ＡＴＰ

检测范围为ｏ．ｏｌ～ｌＯ，０００ｎｍ０Ｊ／Ｌ水平…Ｊ。随者固定化膜技术及生物传感器的发展，荧

光素酶的应用范围将更宽广。

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ｉ为执行国务院发布的《关于在我国统一实行法定计量单位的命令》规定，根据中华人民共睾

｝和国国家标准（ＧＢ３ｌ∞～３１０２—９３）《量和单位》一书所述内容，现将车刊常用的计量单位符号睾

ｉ介绍如下，希广大作者参照执行。

ｉｌ年一ａ；日（天）一ｄ；时一ｈ；分一ｍｉｎ；秒一ｓ；吨一ｔ；公斤（千克）～ｋｇ；克～ｇ；毫克；

事一ｍｇ；微克一ｐｇ；纳克一“ｇ；原子质量一ｕ（ｈ）；井一Ｌ；毫升一ｍＬ；微升～止；克分子浓度：睾

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荧光素酶研究进展

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年，卷(期)：

被引用次数：张菊梅， 吴清平， 周小燕， 郭伟鹏， 吴慧清， 王元平广东省微生物研究所微生物学通报MICROBIOLOGY2001,28(5)15次

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