第四章 高效液相色谱法
第一节 概述
一、定义与分类
液相色谱是指流动相为液体的这类色谱法的总称。高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，简称HPLC），是一种在经典液相色谱基础上发展起来的实用、快速，高效及高灵敏度的分离分析方法。
根据固定相的不同，HPLC可分为以下几类：
1、 液－固吸附色谱法
2、 液－液分配色谱法
3、 化学键合相色谱法
4、 离子交换色谱法
5、 离子对色谱法
6、 凝胶色谱法（又称分子筛色谱法，分子排阻色谱法，尺寸排阻色谱法）
二、HPLC的特点和其它色谱法的比较
（一）与经典液相色谱比较
1、 高分离效能
H=A+B/u+Cu (A=2dp，C与dp2呈线性关系，dp↑→C↑，A↑)
经典柱色谱填料颗粒粒径一般大于100um，颗粒较大，传质扩散缓慢，手工装柱不易装均匀，涡流扩散现象较严重，因此经典液相色谱法柱效较低，分离能力差，只能胜任各组分分配系数相差较大的样品（各组分性质相差较大的样品）的分离，HPLC填料粒径一般为5-10μm，传质快，采用高压均浆技术装柱，装柱均匀性号，涡流扩散小，因此HPLC柱效很高，比经典柱色谱高数百～数千倍，25cm长的硅胶柱柱效可达2万理论塔板，能胜任复杂物的分离，峰容量大。
2、 快速，省时，省材料
经典柱色谱中的柱子多为一次性使用，且体积大（0.1～2m长，0.5～5cm粗），分离速度慢（几小时～几周），每次均要重新装柱，造成人力，物力及时间上的浪费，而一根HPLC柱能重复使用数百次，此外，由于配备了高压输液泵可实现快速分析。
3、 灵敏度高，准确度高，可达1％的分析精度
柱色谱及薄层色谱（TLC）在进行定量分析时影响因素较多，故准确度及重现性
均不如高效液相色谱。
HPLC与经典液相色谱的比较
（二）与GC比较
1、 适合于热不稳定性样品的分析
GC中使用气体为流动相，要求被测样品在气化室高温气化后方可在柱上分离，这就使得热不稳定性样品用
GC分析比较困难，需衍生化以保护被测物的不稳定基团
2、 有利于有机酸，碱等极性化合物的分离
这些物质用GC直接来测定时，由于有较大的极性，一方面易产生托尾的现象，另一方面，保留时间过长，因而测定困难，需利用衍生化来减小其极性后方可GC分析
3、 可分离离子型化合物及蛋白质，肽类等大分子化合物
这些物质无法气化，不可GC分析。
总之，HPLC与GC各有所长，互相补充，均成现代分析中不可缺少的工具。
第二节 液－固吸附色谱及液－液分配色谱
一 液－固吸附色谱（LSC）
(一) 定义
色谱分离是基于吸附效应的色谱法称为吸附色谱，又称液－固吸附色谱、正相色谱法（normal phase chromatography，NPC）。
液－固吸附色谱是最早出现的，也是最基本的一种柱色谱类型。在吸附色谱中，样品组分（溶质）受到两种力的作用，一是固定相对它的吸附力，二是流动相的“拉力”或溶解力，即溶质处于这两相作用力场的平衡之中。吸附力强而溶解能力差时，溶质有较大的保留；反之，则较先流出色谱柱。溶质，吸附剂和流动相溶剂分子三者间的相互作用，涉及偶极之间的诱导力，静电力，氢键力，色散力，电荷转移或∏络合物形成等相互作用类型。在氧化物型极性吸附型上，静电，诱导，氢键等特殊作用力为主要的作用力，色散力微不足道。但在非极性的固定相，例如多孔碳的情况下，非特殊的色散力是固定相与溶质分子间唯一的相互作用力。
（二）固定相
液—固吸附色谱固定相分类如下：
极性 极性吸附剂 酸性吸附剂： 硅胶、硅酸镁碱性吸附剂：氧化铝、氧化镁
非极性吸附剂：活性碳 薄壳型（表面多孔层）：优点：传质快，渗透性好； 缺点：比表面积小，样品容量小（
硅胶
结构
无定形 全多孔型（表面多孔层）：球 形 优点：比表面积大，样品容量大（mg/g） HPLC
中液—固吸附色谱固定相用的主要是硅胶。其次是氧化铝。结构类型主要采用薄壳型及全为多孔微粒型两种。
薄壳型及全为多孔微粒型硅胶的示意图
硅胶表面上的活性作用点：
液—固吸附色谱的保留机理：极性。极性小的组分先出峰（正相色谱）。
液—固吸附色谱样品的分离主要是因分子中的极性官能团与固定相表面上活性作用点（如硅醇基）之间的相互作用，这种极性相互作用的强弱归纳如下：
硅胶上各类化合物或官能团吸附强弱的分类
例如：环丙氟哌酸的中间体2，4—二氯氟苯的合成工艺如下：
Cl
NHAcClNHAcClClHO+ClNH2
(1)
(2) (3)
ClCl
NO2ClClF
(4) (5)
现对合成的最终产品2，4—二氯氟苯进行纯度检查。采用的检查方法为HPLC，以硅胶柱分析得到如下色谱。试判断图中各峰所对应的化合物（归属）。
⑤
④
① ③ 0min 20min
（三）流动相
LSC中使用的流动相为各种有机溶剂，主要为非极性的烃类（如己烷、庚烷），某些有机溶剂（如二氟甲烷、甲醇、二乙胺等）作为缓和剂加入其中以调节流动相的溶剂强度、极性及PH值，即进行所谓正相色谱、极性越大的组分保留时间越长。
1. 混合溶剂
液固色谱中广泛使用混合溶剂（二元、三元体系等），这是因为虽然不同的纯溶剂有不同的溶剂强度。但他们不一定是进行LSC的最佳溶剂强度。我们可以利用不同组成的混合溶剂获得任意需要的溶剂强度。
流动相主体：弱极性的戊烷、己烷、庚烷等。
改 性 剂：调节流动相的洗脱强度与峰形。
中等极性：二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯。
极性溶剂：四氢呋喃、乙腈、异丙醇、甲醇、水等。
碱性物质：如三乙胺等→分离碱性样品，避免峰拖尾或不可逆的保留。
2. 水的影响
硅胶及氧化铝为良好的干燥剂。水的含量对该类吸附剂的活度有很大的影响，即使有极微量的水吸附在其表面上，也会使吸附剂活性大大降低。
（四）液—固色谱的应用
随着HPLC技术的发展，虽然原来许多使用LSC模式的分离分析被更方便、稳定的化学键合相所代替，但在以下几个方面仍有其独特的意义：
1. 异构体的分离
许多异构体使用化学键合相来分离是不可能的或者是很困难的，而采用以硅胶为固定相的LSC却很容易分开。
2. 样品预处理
许多生物样品可使用经典LSC来进行纯化，除去蛋白质等干扰物，然后再进一步以GC或HPLC等分离分析。
3. 制备色谱
由于硅胶比较便易。所以进行分离比较有利，同时流动相为有机溶剂，容易挥发。便于产物提取。
4. 常用于HPLC-GC联用技术
由于流动相为有机溶剂，易于汽化，所以目前90%的HPLC-GC中的HPLC部分采用LSC，进行正相HPLC。
二、液-液分配色谱法（LLC）
（一）定义
色谱分离是基于样品组分在固定液和流动相之间分配的不同色谱法称为液-液分配色谱法。
这种方法的基本原理是物质在两种液相间的分配。它类似于实验中常用的液-液萃取法。其保留机理为溶解度。物质在固定液中的溶解度越大，保留时间越长。
（二）固定相
LLC的固定相为载体上涂渍的固定液。
1. 载体
原则上，所有多孔性的吸附材料均可作为固定液的载体。一般常用硅胶，硅藻土等。结构类型主要采用多孔层微珠及全多孔微粒型二种。多孔层微珠是较早使用的一种载体，它柱效好，分析时间短；但它的多孔层很薄，只能涂渍少量固定液（最大涂渍1~2%），故柱容量低，柱稳定性也差，因为少量的固定液流失将大大改变保留体积。全多孔微粒（如硅胶）孔容大（≈1ml/g），可涂渍较多的固定液，涂渍量可达1克固定液/每克载体（称为100%涂渍），其柱效比前者高，且柱容量高，柱子稳定性也好——载体上涂渍的固定液越多，则因固定液流失对样品保留体积的影响就越不显著，理想的载体应该具有如下特点：
1）孔容大
2）孔径应为100~500埃之间，孔径太小较大的分子可能被完全排阻，而保留时间更短，分离不佳。孔径太大，则固定液易流失，柱稳定性差，由于毛细管作用，固定液在小孔要比大孔内保持的好。
2. 固定液
固定液可采用气相色谱中常用的某些固定液，如不同聚合度的聚乙二醇、甲酰胺、丙撑二醇等。然而，对这些固定液，适合作为流动相的只有非极性链烃，最多再加入少量（最高10%）的氯仿，四氢呋喃和其他醚。所有常见的洗脱液都是这些固定液的良溶剂。但由于许多有机物样品在上述洗脱液中的溶解度很小，所以这类体系的适用性是有限的。
LLC的固定液的选择也可参考纸色谱法中使用的体系或从多组分中萃取已知组分的分配体系。如在纸色谱里，甾体药物可以在浸渍甲酰胺的纸上容易地分离，如果把甲酰胺涂在硅胶上，那么甾族化合物就能用高效液相色谱分离，因为甲酰胺即使在中等极性的溶剂苯、二氯甲烷中也几乎是不溶解的。
3.载体的涂渍
采用GC中常用的固定液涂渍方法。
（三）流动相
采用与固定液性质相差很大的不混溶的溶剂为流动相，流动相使用前需预先用固
定液饱和，或在分析柱前增加预饱和柱，以避免固定液流失。
（四）应用
LLC较适合于分离中等极性和极性物质，这些物质对LSC来说极性太高，LLC的应用范围几乎全被键合相色谱所包含，故现在已很少使用。
三、正相硅胶反相洗脱（NS/RE）色谱法
（一）固定相
本法采用未改性的原形硅胶为固定相，以水性溶液作流动相。常用于分析中药中的生物碱成分，或化学合成的生物碱类药物。
该方法的保留机制是基于硅胶表面的硅羟基在一定的条件下具有离子交换特性，改变任一流动相条件（pH, 离子强度，含水量），都会对保留时间产生影响。
（二）流动相
该法常用的流动相为：乙醇（或甲醇）—1~3%三乙胺水溶液（磷酸或醋酸调节pH值至6~7.5）（85：15）或（80：20）。该法的色谱保留机理相当于离子交换机理，主要依碱性强弱出峰。色谱峰的对称性很好，峰形尖锐。适合于分离在反相HPLC中不宜分离的生物碱类混合物（反相HPLC中生物碱可能拖尾及峰展宽，有时tR相差很大）。
影响NS/RE色谱保留的因素如下：
1. 水的比例增加，洗脱能力减小；
2. 三乙胺浓度升高，对含碱性基团组分的洗脱能力提高，保留时间缩短。流动相中三乙胺为阴离子竞争离子，用于竞争硅羟基，以消除硅羟基对生物间的吸附。
3. pH值对NS/RE的色谱保留具有两面性。一方面，增大pH值，硅醇基解离程度提高，离子交换特性增强，使保留时间增大。但另一方面，对于碱性化合物，增大pH会压制该化合物的解离，反而会使保留时间缩短。流动相的pH值以pH 6~7为好。原因有三：（1）pH太低，硅羟基失去离子交换能力。（2）pH值太高弱碱性药物不易离子化。
（3）pH值太高，硅叫在碱性溶液中有一定的溶解度。
4. 非解离型物质在该系统的出峰顺序类似于RP-HPLC（硅氧烷基疏水）
（三）柱子的培养
由于流动相中含有三乙胺，三乙胺吸附在硅羟基上。很难以甲醇清洗，所以每次做完样品，先以0.1%冰乙酸冲洗15-20min,洗去三乙胺，然后再用甲醇冲洗20min。经这样处理后，柱压可长期保持不变，达到保护柱子的目的。
第三节 化学键合相色谱
一、 意义和特点
化学键合相色谱使用的固定相是借助于化学反应的方法将有机分子以共价键连接在色谱担体上的，主要用于反相、正相、离子交换及离子对色谱中。据统计。键合相色谱在高效液相色谱的整个应用中占80%以上。
要形成化学键合固定相，有两个必要条件：一是所用的担体材料应有某种化学反应活性，如硅胶、氧化铝、硅藻土等表面都具有化学反应的官能团；但以硅胶为最理想的和最常用。二是有机分子应含有能与担体表面发生反应的官能团（详见下节讨论）。硅胶（SiO2·xH2O）之所以是理想的化学键合相担体，主要由它的表面性质所决定。硅胶表面硅原子主要以硅醇基（≡Si-OH）和硅氧烷形成存在，这种硅醇基是进行键合的活性官能团。
OH
Si OSiOSi
自由型硅醇基 硅氧烷型
按照晶体点阵计算，硅胶表面羟基数目可达到8个/nm2,但用化学方法测定的羟基数一般认为是约5个/nm2。硅胶表面存在着足够的可反应硅胶基，再加上硅胶本身的许多特点，例如强度好，孔结构和表面积易于人为控制，有较好的化学稳定性等，因而是各种化学键合相理想基质材料。
化学键合相在HPLC中的应用，引起了一场巨大的变革。使得较早出现的液-固吸附色谱及液-液分配色谱大量地被键合相色谱所取代，某些离子型的物质也从用传统的离子交换树脂分离改用离子交换键合相或反相离子对色谱分离。归纳起来，化学键合相主要有以下几个优越性。
1. 消除了担体上的表面活性作用点，清除了某些可能的催化活性。
这样就缓和了一些复杂样品在固定相表面上的不可逆化学吸附，使得操作简化，峰形对称；对溶剂中微量水分含量的变化要求不苛刻；此外，溶剂的残留效应小，梯度冲洗平衡快。这是键合相色谱在许多方面取代液固吸附色谱的主要原因。
2. 耐溶剂冲洗。
这是传统的液-液分配色谱（LLC）逐渐被键合相色谱取代的根本原因。LLC中
固定液的流失十分严重，为了克服这个缺点，曾采取溶剂预先用固定液饱和及柱前增加预饱和柱的方法，但这样做既不方便，柱系统的稳定性也差。化学键合相色谱的固定相永久性的键合在担体上，不会流失。
3. 热稳定性好
每种键合相均有其相应的最高使用温度，在此温度下可进行升温HPLC。如十八烷基键合相的流失温度在220℃以上。
4. 表面改性灵活，容易获得重复性产品
。改变键合用有机硅烷，可得到不同的键合相填料，以适用于各种类型的试样分离。控制硅胶的质量和键合工艺，可得到重复性产品。 二、制备和性能评价 （一）制备
在制备键合相时，首先作为担体的硅胶需要酸处理，使表面的硅氧烷键打开，形成尽可能多的自由羟基，有利于反应。
i
O
Si
OH
+
OHO
i
i
酸处理也可除去表面层的金属氧化物杂质和孔隙中的细粉。然后中和，在200℃以下烘干除去物理吸附水（不得超过200℃，否则硅醇基脱水形成硅氧烷结构），再以过量的硅烷化试剂进行化学键合。 （1）反应
键合反应的类型：Si-O-Si-C键型（硅胶与有机硅烷反应产物）
这是一类目前占绝对优势的键合相类型，具有良好的热稳定性及化学稳定性，能在pH 2～7.5的介质中使用。它是利用氯硅烷或烷氧基硅烷与硅胶反应而得。
CH3
OH
CH3
R
O
iCH3
R
X
CH3
X为Cl、CH3O或C2H5O。 R为辛烷基、十八烷基、苯基等。
如Bondapak-C18键合相，即为R = 十八烷基。
Si
OSi
OHOH
+X3SiR
Si
OSiO
O
SiRX
+ 3HX
X：-Cl、-OH、-OCH3、-OC2H5
R：-C8H17、-C18H37、-(CH2)nCN、-(CH2)nNH2
Si
OSi
OHOH
+X2SiRSi
OSiO
O
SiRR+ 2HX
Si
OH+XSiR3
SiOSiR + H
X
H3
H
+
X
(CH
2)17CH
3
bonding
(CH
2)17CH3
CH3
（2）端基封尾(endcap)－－消除残余的硅羟基
由于空间位阻的缘故，较大的硅烷分子不可能与担体表面上较小的硅醇基全部发生反应。因而残余羟基是不可避免的。为了进一步消除残留的游离硅醇基，一般在键合反应后再用一氯三甲基硅烷或六甲基二硅氨烷钝化。也可用十八烷基三氯硅烷再键合一次。
（3）常见的官能团
（4）常用的键合相商品牌号安捷伦公司（Agilent）：Zorbax Zorbax 由著名的色谱科学家Kickland研制，并由杜邦公司所生产和销售的系列色谱填料的注册商标。现在，Zorbax的全部生产线已并入Agilent公司。
Waters公司：Bondapak 、μ BondapakTM、XterraTMμ BondapakTM C18性能重现性非常好。能经历20多年但性能基本上保持一致的HPLC并不多， μ BondapakTM C18是其中一个代表性的品种。
瑞典Akzo Nobel公司：Kromasil ：Kromasil 硅胶的质量较稳定，但柱压较高。 Merck公司：LiChrosorb、LiChrospher、Nucleosil
（二）化学键合相性能评价
由于各种键合相均以硅胶为基质，可以认为是一种改性硅胶。在化学键合相色谱中，代表色谱保留ｋ＇是与键合在硅胶表面有机基团的覆盖量直接有关，因而键合相表面改性的完全程度和重现性是色谱用户和制造厂家共同关心的。重复性和改性完全程度可通过残余羟基，覆盖度和覆盖均匀性表示。测定和评价的方法有微量元素分析、色谱、光谱、核磁共振法等。
１． 微量元素分析或热失重法 本法直接测定键合相的碳含量：C%
键合相中C的重量
担体的重量
100%
这个值在２～２９％之间变化。由于Ｃ％随基质比表面积（Ｓ）和键合有机基团的分子量（Ｍ）变换，所以在研究和比较的工作中采用表面键合相浓度α表示，即单位表面积所含键合相的浓度(umol/m2)：
=
WMS
式中，w为1g担体上键合有机物的重量（μg）；M为键合有机基团的分子量；S为担体比表面积（m2/g）。
W用碳含量表示： W=
C%12Nc
M10
6
式中，12为碳的原子量；Nc为键合有机基团的碳数。 有时也用表面覆盖度表示键合量。 表面覆盖度=
单位表面键合有机基团单位表面含有可反应硅
的微摩尔数醇基的微摩尔数
=
510
1817
=
8.3
6.0210
这里假定硅胶表面可反应的硅胶基数目为5个/nm2，6.02³1017为以微摩尔为基准的阿佛加德罗常数。
2. 色谱法
键合相的性能用色谱方法评价是很自然的，因为它最终用于色谱，所以生产厂家一般都给出产品附上特定标准物苯及联苯的保留值和柱效率，或者其它参数的测试结果。例如对反相填料在甲醇-水条件下考察对芳烃、苯、萘、联苯的分离情况。也有人提出用非极性键合相填料正相洗脱的方法检查残余羟基的含量，即用庚烷作流动相。若残余羟基甚少，则象甲醇、丙酮等极性化合物的保留时间与tm相近。且峰形对称。
若残余羟基甚多。则情况相反。这种方法评价较为多客观。
3. 光谱法
光谱法也是考察填料表面羟基含量的重要手段。这是基于Si-OH基在3750cm-1
处有特征的红外吸收谱带，借此可以获得某些信息。 三、 分类
化学键合相的分类可以有不同的依据。按键合相的表面结构分为单分子键合和聚合键合；按键合有机硅烷的官能团分为极性键合相、非极性键和离子交换键合相三种。 四．极性键合相色谱
极性键合相指键合有机分子中含有某种极性基团。和空白硅胶相比，这种极性键合相的表面能分布相对均匀，因而吸附活性比硅胶低，可以看成是一种改性过的硅胶。最常见的极性键合相有氰基（-CN，Cyano-）、二醇基（diol）、氨基（-NH2，amino-）等。商品键合相一般均以上述基团命名，如Lichrosorb NH2，u-Bondapak CN等。也有的商品键合相并不注明是什么基团。
对于极性键合相来讲，一般键合表面由三部分组成：键型、主体基团、极性端基。
键型：如Si-O-Si-C。它是整个极性键合基团与硅胶母体直接相连的桥梁。 主体基团：一般由直键烃基或醚基所组成，其作用为使硅胶表面与特定的极性基团之间保持一定距离。
极性端基：由带极性基团（如NH2，ＯＨ）的烃基或芳基组成。
大多数情况下，极性键合相的制备分三步进行。第一步是在硅胶表面先接一个正烃基或正芳基硅烷，然后再以相应的取代反应引入极性基团。由于空间位阻的影响，上述反应不能象相似相溶液那样完全，一般靠碳和氮含量来计算表面覆盖程度。
上述三种极性键合相都是一氢键力作用，其中氰基是一种氢键接受体，而后两种兼具氢键接受体和给予体两种性能。对于有较强氢键作用力的样品，在后两种键合相上的保留值大，所得ｋ＇值也大。
极性键合相一般都用作正相色谱，即用非极性或极性小的溶剂（如烃类溶剂）加
入适量的极性溶剂（如氯仿、醇类、乙腈等），以调节控制洗脱液的洗脱强度。分离组分的出峰顺序与组分的极性大小顺序相同，即极性弱的先出峰，极性强的后出峰。但对强极性的化合物，上述极性键合相也可用反相色谱，如分离糖类或多肽化合物时，用乙腈-水作洗脱液也可以得到良好的分离效果。
极性键合相的保留机理既有吸附的因素，也有分配的因素。一般认为吸附过程是主要的相互作用过程，通过填料表面极性基团的偶极诱导，或氢键，或静电作用和溶质分子发生相互作用，达到分离目的。
极性键合相色谱提纲：
1、键合表面的基团组成键型：Si-O-Si-C或Si-O-Si-N
主体基团：直链烃基或醚基极性的端基：氨基（-NH2）、氰基（-CN）、二醇基（diol）、芳硝基、醚基
LiChrosorb NH2、 LiChrosorb Diol2、分离机理作用力：氢键力氰
基：氢键接受体
氨基、二醇基：氢键接受体与给予体
联苯胺、苯胺k’:氨基>氰基（学生思考原因）
3、色谱分离方式1）一般用作正相色谱流动相：弱极性溶剂 ＋ 适量极性溶剂 （烃类） （氯仿、醇、乙腈）溶质保留规律：
A 溶质的分离是基于亲水结构的差异； B 溶质的极性越大，保留值越大； C 流动相极性越大，洗脱强度越大。 2）也用作反相色谱
分离样品：强极性化合物，如糖类、多肽
五．离子交换键合相色谱
离子交换色谱早期都采用高分子聚合物（如聚苯乙烯树脂）为基质的离子交换树脂作用定相。在HPLC中，这种固定相由于溶胀性，不耐高压，以及表面的微孔型结构影响传质速率，现已被离子交换键合相所代替。
在化学键合的有机硅烷分子中带上固定的离子交换基团，便成了离子交换键合相。若带上磺酸基(-SO3), 羧酸基（-COOH），就是阳离子交换剂，若带上季氨基（-R4N+）或氨基（-NH4）就是阳离子交换剂。
离子交换键合相多以薄壳型或全多孔微粒硅胶为基质，具有较高的耐压性，化学及热稳定性。由于有较好的机械强度，耐压，这类微粒型键合相可以高压匀浆装柱。但它们的pH适用范围只能在pH 2~8。pH＞9时，硅胶便容易溶解。特别是未键合的残留硅羟基容易生成硅酸盐。
离子交换容量是很重要的。交换容量越大，负载能力越大，ｋ＇值也越大。离子交换键合相的交换容量与固定相的表面积直接有关。全多孔微粒型固定相的交换容量较大，一般为毫克当量水平（0.2~0.5毫克当量/克）；薄壳型由于表面积较小，一般只有微克当量级（30~60微克当量/克）。交换容量可用酸碱滴定法测定。
在离子交换键合相色谱中，离子交换键合相色谱的流动相多为控制一定的pH的缓冲液。流动相中往往加入有机成分作为改性剂。溶质的保留值受流动相的pH值、离子强度以及有机改性剂的影响，溶质的保留兼有离子交换和吸附双重机理。
1. pH值对保留时间的影响
弱酸及弱碱的保留值
与洗脱液的pH值有关，它们或者先解离并参加离子交换而被分离；或者不解离。不参加离子交换，而以分子形式几乎无保留地通
过柱子（实际上由于极性基团微弱的吸附作用而产生很小的保留作用）。
在强阴离子交换键合
PH
相上分离弱酸性有机阴离子时，当pH过高（如pH＞7时），有机酸完全电离，牢固地吸附在固定相上，ｋ＇很大，难于洗脱，此时便于无分离作用。又如在阳离子交换键合相（-SO3H）上分离碱性药物时，当pH过高，固定相转变成钠型（-SO3-+Na），碱性药物以游离碱形式存在，无交换能力，ｋ＇很小。也无法达到分离目的。例如，在分离腺嘌呤及胞嘧啶时以正丁基磺酸（键合在硅胶上）作为固定相，采用0.1mol/L的磷酸盐缓冲液（pH2.5~7.5）作为洗脱液。不同的pH对ｋ＇的影响见图1。pH大于6时，两碱性样品的ｋ＇都在1~1.5之间，在这样的pH下，交换集团完全是以Na+的形式存在的，而游离的胞嘧啶及腺嘌呤无法与Na+离子交换。当pH值减小时，碱性样品的ｋ＇值增加。在低pH值得情况下，ｋ＇重新与pH无关，因为这时碱完全被质子化而牢固地吸附在固定相上，ｋ＇很大，不易洗脱。曲线的转折点近似相当于两碱性药物的pkb值，在这种情况下，碱与它们的盐以1：1的比例平衡。
由上述可见流动相的pH选择应适中，最好选择在被分离的酸或碱的pka或pkb附近，使它们解离适中，达到最佳分离。
为提高分离度，可采用不同pH的缓冲液作为梯度淋洗，通过选择适当的洗脱条件，可以得到很好的分离效果。如在分离有机酸混合物时，随着pH值得减低，酸性弱（pka较大）的组分先洗脱出，然后再降低pH，酸性较强（pka较小）的组分也被洗脱出来。
（1）在用强阴离子交换键合相分离酸性药物时，pH↑→药物解离度↑→ｋ＇↑，保留时间↑。
（2）在用强阳离子交换键合相分离碱性药物时，pH↑→游离碱↑→ｋ＇↓，保留时间↓。
2. 离子强度对保留值得影响
离子强度（缓冲盐浓度）增加，ｋ＇减小。如图2，在前述固定相分离腺嘌呤及胞嘧啶时，ｋ＇随NaH2PO4盐浓度的变大而减小，成反比。原因归结于离子交换平衡的移动。
3. 有机改性剂对保留的影响
如果洗脱液中加入极性有机组分（如乙醇），则抑制离子交换，并且产生按分配机理进行的分离。
六、非极性键合相色谱（Non-polar bonded phase chromatography）
又称反相键合相色谱（Reversed phase chromatography）, 这主要是因为所用的键合固定相表面都是极性很小的烃基，如十八烷基、辛烷基、甲基、苯基等，而洗脱液大都采用强极性溶剂（水、醇、乙腈）或无机盐的缓冲液。在这种键合相色谱中，洗脱次序恰与正相色谱相反，即极性大的化合物先洗脱（ｋ＇小），极性小的化合物不易洗脱（ｋ＇大）。该类键合相中最常用的是十八烷基硅烷键合硅胶，又称ODS。 （一）反相键合相色谱的分离机理
1．疏溶剂作用理论（Solvophobic interaction）
当一个溶质分子的非极性部分与极性溶剂接触时，相互产生斥力。这种效应称为“憎水”或“疏溶剂效应”。当溶质进入到极性流动相中时，分子中的非极性部分总是趋向与其它非极性部分聚集在一起，以减少与极性溶剂接触的面积．而使体系的能量最低。图中黑箭头表示疏溶剂力，空心箭头表示溶质分子与极性溶剂的作用力。
疏溶剂作用理论以解释单分子层键合相的色谱保留机理：该理论认为非极性烷基键合相是在硅胶表面蒙覆了一层以Si-C键化学键合的十八烷基（或其他烃基）的“分子毛”。
这种构成“分子毛”的长键烃基具有强的疏水特性。对于一个被分离的有机化合物来讲，可把整个分子看成是非极性部分和极性官能团部分所组成。溶质分子与键合相表面的烷基之间的疏溶剂作用是溶质分子S与键合烷基L间的一种可逆缔合作用。
S + L
LS
缔合作用强度和溶质的色谱保留值取决于以下三个因素： （1） 溶质分子中非极性部分的总表面积； （2） 键合相上烷基的总表面积； （3） 洗脱液的表面张力
（1） 溶质分子中的非极性部分总表面积越大，缔合作用越强。
在一定的洗脱液和温度下，logｋ＇与该总表面积成正比。但如分子中非极性部分相同，而增加极性基团，则因为增加了溶质分子与洗脱液的极性分子间的作用力而使ｋ＇减小。
（2）logｋ＇与键合相表面烷基的总表面积也成线性关系，烷基越大，ｋ＇越大。
烷基数量越多，溶质保留越强。 烷基碳链越长，溶质保留越强
图2为几种酚类化合物在不同长短碳链的非极性键和相上所得logｋ＇比较，OH数越多，ｋ＇越小，键合相链长越长，ｋ＇越大。
logk’
OH
OH
HO
OH
OH
图2溶质极性，键合相链长与logｋ＇关系
（2） 洗脱液的表面张力也是影响ｋ＇的重要因素。表面张力越大，则S与L缔合时
释放的能量越多，ｋ＇也越大。
洗脱液中极性有机溶剂增加。其表面张力就越小，ｋ＇也随之减小，如果把电解质（如缓冲液或中性盐）加入到洗脱液，则表面张力随着盐浓度的增加而增加，ｋ＇也就越大。这也是反相键合相的选择原则。如醇-水洗脱液中增加醇的比例ｋ＇就减小，增加水的比例ｋ＇就增加。加入无机盐ｋ＇增加。
2．双保留机理
烷基键合相表面往往还有残余硅醇基，这是一种微量酸性的基团，可与溶质阳离子或氢键基团相互作用，这种作用叫做“亲硅醇基效应”（Silanophilic interaction）。双保留机理认为溶质的保留值应包括两部分的贡献，即疏溶剂效应和亲硅醇基效应。
色谱中的双保留机理往往导致一些不利的影响，如柱效低，峰形拖尾等。为了克服这个缺点，在一些特定的场合下，例如进行碱性化合物的分离时，往往向流动相中加入某种胺类添加剂，让游离的-NH2基与残余Si-OH首先作用，从而掩盖了溶质分子与键合相的亲硅醇基效应。
（二）流动相
反相HPLC的流动相一般选择（1）甲醇—水及（2）乙腈—水两种系统。此外，还可考（3）四氢呋喃—水。
系统（2）较系统（1）好，原因如下：
A) 系统（2）的粘度较系统（1）小，柱效好些。
（注：粘度↑→ 柱压↑，传质阻力↑（溶质扩散阻力↑）→ 柱效↓） B) 乙腈的紫外末端吸收较甲醇小，在低波长处测定时，基线波动较甲醇小，测
定误差小。
1．对于中性药物而言
（1）待测物极性较大时，则选择：水相比例较大。
甲醇—水，乙腈—水的常用比率为（20-35：80-65）。即（20：80）—（35：65）
例1. 柴胡皂甙C（Saikosaponin C）
O
CH2OH
OOHOOHOH
OO
OH
O
CH2
OOH
O
OH
CH3OHO
H
色谱柱：YWG ODS A-311 (6.0 mm, I.D.³10 cm) 流动相：乙腈：水（28：72）
流速：3 ml/min 检测波长：203 nm
例2. 栀子甙（Geniposide）
CH3
色谱柱：Spheri-5 RP-18, 5m (4.0 mm, I.D.³25 cm) 流动相：甲醇：水（35：65）
流速：0.8 ml/min
检测波长：240 nm tR：7.77 min
（2）当待测物的极性较小时，则选择：有机相比例较大。
甲醇—水，乙腈—水的常用比率为（60-80：40-20）。即（60：40）—（80：20） 例：醋酸甲羟孕酮（Medroxyprogesterone acetate）
COCH3
3
色谱柱：Hypersil ODS (4.6 mm, I.D.³25 cm) 流动相：甲醇：水（70：30）
检测波长：240 nm tR：7.3 min
2．对于碱性药物而言
由于“亲硅醇基效应”，固定相上残余的硅醇基往往使生物碱峰拖尾或被吸附。解决办法如下：
（1）向流动相中加入胺类添加剂—作为扫尾剂，同时又起到离子抑制的作用。 如：三乙胺（0.05 %），二乙胺（0.0125 %），正丁胺（10mmol/L） 例：替诺昔康（Tenoxicam）—西药：非甾体抗炎药。解热、镇痛、消炎。
在甲醇—水的系统中，该药出现明显的拖尾现象，加入少量的三乙胺作为扫尾剂，峰形改善。
O
OH
N
色谱柱：Spherisob C18, 5m (4.6 mm, I.D.³15 cm) 流动相：甲醇：水：三乙胺（18：86：0.05）
流速：1 ml/min 检测波长：361 nm
（2）加入反离子，利用离子对色谱来解决。（Pair ion Chromatography, PIC） 常用离子对试剂：烷基磺酸盐。如：正戊磺酸钠（PIC-B5），正己磺酸钠（PIC-B6），正庚磺酸钠（PIC-B7），正辛磺酸钠（PIC-B8），十二烷基磺酸钠（SDS）。
在相同的色谱条件下，反离子的烷基增加一个碳将使保留时间延长很多。十二烷基硫酸钠有时使保留时间过长，此时可换低碳烷基的离子对试剂，如庚基磺酸钠（PIC-B7）或辛基磺酸钠（PIC-B8）等。
流动相配制：
在甲醇—水（或乙腈—水）系统中加入PIC试剂（市售为浓溶液）使其浓度为3-10 mmol/L,并以磷酸二氢钾及磷酸调节流动相至适当的pH值。 用离子对色谱法分离测定碱性药物时，流动相pH=3-3.5即可。 例1. 左卡尼汀（Levocarnitine）
OH
CH3CH3CHN
CH2
C
CH2
COO
H
色谱柱：Hypersil ODS, 5m (4.6 mm, I.D.³20 cm)
流动相：以含有2.8 mmol/L庚烷磺酸钠的0.05 mol/L磷酸盐缓冲液（取11.5 ml磷酸至1900 ml水中，用1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH值为2.4，每98 ml上述溶液中加入55.5 mg庚烷磺酸钠，摇匀）—甲醇（98：2）
流速：1 ml/min 检测波长：225 nm tR：7.5 min
例2. 盐酸苯乙双胍（Phenformin Hydrochloride）
流动相：甲醇：水（1：1），含0.02 %冰乙酸和5 mol/L庚烷磺酸钠（pH 3.7）
（3）pH控制离子化以控制保留
低pH值可加快碱性化合物出峰，并抑制“亲硅醇基效应”。 例：止咳化痰丸重麻黄碱及伪麻黄碱的测定 色谱柱： ODS, 10 m (3.9 mm, I.D.³30 cm)
流动相：0.01 mol/L磷酸氢二钾（用磷酸调至pH 2.5）— 甲醇（96：4）。
3．对于酸性待测物而言
先用甲醇—水，乙腈—水两种系统。很多酸性药物能用这两种系统进行分离分析。 例：厚朴酚（Magnobol）
色谱柱：YWG ODS 10 m (4.6 mm, I.D.³25 cm) 流动相：甲醇：水（75：25）
流速：1 ml/min 检测波长：294 nm tR：9.6 min
当甲醇—水，乙腈—水，四氢呋喃—水系统不行时，可考虑以下办法。
（1）离子抑制色谱法（Ion Suppression Chromatography）：
通过调节流动相的pH值，抑制组分的解离，增加它在固定相中的溶解度，以达到分离目的。
（1） 适用范围：
适合于3.0≦ pKa ≦7.0的弱酸。
对于pKa
（2） 抑制剂：
通过向流动相中加入少量弱酸（常用醋酸）或缓冲盐（常用磷酸盐急促酸盐）为抑制剂，调节pH，抑制组分解离，增加中性分子存在几率。对于酸性药物，pH小于pKa时，药物多数以分子形式存在。pH ↓→ k↑,tR ↑ 离子抑制色谱中流动相的pH需在2-7.8之间，以防键合相脱落。 分析酸性药物时，常在流动相中加入0.3-2%的冰醋酸。
例1：血样中二氟尼柳（diflunisal）
COOH
F
F
OH
色谱柱：Spherisorb C18 5 m (4.5 mm, I.D.³25 cm) 流动相：甲醇：水：冰醋酸（66：30：1） 例2：血样中醋氯芬酸（aceclofenac）
l
NHCl
CH2COOCH2COOH
色谱柱：Spherisorb C18 5 m (4.0 mm, I.D.³15 cm) 流动相：甲醇：水：冰醋酸（65：35：2） （2）离子对色谱
对酸性药物：流动相pH≈7.5
常用离子对试剂：四丁基季铵盐（PIC-A）
四丁基胺磷酸盐（TBA等）
例1：蒽环类抗生素（8种）
O
O
H
2OH
R1OOH
色谱柱： Bondapak C18 (4.6 mm, I.D.³30cm)
流动相：甲醇：水(含10mmol/L四丁基磷酸盐)（65：35）
流速：1 ml/min
（三） 反相HPLC分析酸性和碱性药物时的常见问题及解决方法
1、分析碱性药物时会遇见的常见问题及解决方法：
常见问题：（1）拖尾或不出峰（亲硅醇基效应所致） 解决方法：（a）流动相中添加小分子有机胺
（b）离子对技术 （c）缓冲液
（2）峰裂分或多重峰（二次化学平衡所致） 解决方法：（a）流动相溶样后再进样 （b）调整进样溶液的pH值。 2、分析酸性药物时会遇见的常见问题及解决方法：
常见问题：（1）峰形拖尾或不对称（主要由待测物离子化所致）
解决方法：调整流动相pH值至酸性或加入酸性缓冲液进行
离子抑制。
（2）峰裂分或多重峰（二次化学平衡所致） 解决方法：（a）流动相溶样后再进样 （b）调整进样溶液的pH值。
第四节 离子对色谱（Ion-pair chromatography, IPC）
一、基本原理
定义：离子对色谱是通过加入合适的反离子（Counter ion）与离子化的试剂形成离子对，这种离子对类同中性或非极性分子一样，从而可采用分配色谱的方法进行分离的一种色谱分离分析方法。
离子对的形成： 试样离子+反离子
±
±
（试样离子反离子试样离子（以A表示）和反离子
±
（以B±表示）均溶于水相，而组成的离子对复合物（以A±·B±表示）易溶于有机相中，可表示为（设试样离子为A±）
Aaq+ + Baq-（A+·B-）org
这一平衡的平衡常数即提取常数，可表示为EAB。
EAB =
[AB]org[A]aq[B]aq
1. 在正相离子对色谱中
流动相中被测样品离子A+与固定相或流动相中带相反电荷的平衡离子（反离子）B-相结合，生成离子对化合物A·B，然后在两相之间进行分配分离。A+在两相之间的分配系数KA为：
KA=
[A]aq[AB]aq
1EAB[B]aq
容量因子ｋ＇KA
讨论： a) 反离子浓度[B-]aq↑
b) AB易被有机相萃取
VsVm
Vs
EAB[B]aqVm
ｋ＇↓，保留时间↓； EAB↑
ｋ＇↓，保留时间↓
相流动相
离子对色谱分离过
程示意图
反相
正相
2.在反相离子对色谱中
固定相为疏水性的键合相（如ODS），被分离的离子A+和反离子B-同时存在于强极性的流动相中，生成的离子对复合物AB在流动相和键合相中进行分配分离，其分配系数和容量因子ｋ＇为：
KA
[AB]org[A]aqVsVm
EAB[B]aq
ｋ＇KA
讨论： a) 增加反离子浓度[B-]aq↑
b) AB易被有机相萃取
EAB[B]aq
VsVn
ｋ＇↑，保留时间↑；
ｋ＇↑，保留时间↑
EAB↑
然而，无论在正相还是反相离子对色谱中。当[B-]aq增大到一定浓度时，样品离子基本上都已转化成离子对AB（不可能100%转化），于是ｋ＇基本保持不变。为了使ｋ＇有合适的数值，即保持ｋ＇在1~10之间，关键是选择合适的反离子种类和浓度。ｋ＇太大，分析时间过长；ｋ＇太小，则分离不开。
离子对色谱保留机理的解释尚有争论，上述假设只是一种离子对模式，除此之外还有动力学离子交换模式和离子相互作用机理。 二、基本方法
1. 正相离子对色谱
采用硅胶、硅藻土或纤维素为担体，合适pH的以一定浓度溶于水或缓冲液的反离子涂于担体上。流动相为弱极性的与水不相容有机溶剂（如氯仿，二氯甲烷等）。有时加入5~10%的亲脂性醇改善峰形。样品溶于有机溶剂或含有反离子的意有机溶剂后进样。（A+·B-）离子对存在于流动相中，可通过不同的反离子改善检测。如使用萘-乙-磺
H
O2N
NO2
酸或苦味酸（
NO2
）为反离子时，能使没有紫外吸收的物质也能被检测。
正相离子对色谱中的反离子是加在固定相中的。色谱过程中要消耗反离子而使色谱系统不稳定，所以在应用上受到限制。
2. 反相离子对色谱
固定相为化学键合相的非极性表面，尤以ODS（C18）及C8反相柱最适宜，流动相同RPHPLC一样，常用甲醇-水，乙腈-水。反相离子对色谱系统稳定，且不存在固定液流失问题。ｋ＇的调节也很方便，可随时改变反离子浓度及pH等。此外，还适宜于梯度洗脱。所以反相离子对色谱乙获得广泛的应用。 三、影响分离的因素
1. pH的影响
合适的pH是离子对色谱的重要条件，它将决定离子型化合物的解离度，为了有最大的保留和响应，希望有最大的解离，但又不能超出柱子所能承受的范围，一般pH为2~7.5，最多不超过9。
分离强酸性药物，pH低也能充分解离，故对pH要求不严；对于弱酸性药物，如磺胺类，巴比妥类药物等，需在pH高时才能充分解离，若pH低，含抑制解离，样品组分呈不解离溶质，则按一般色谱进行。碱性试样的分析可控制在较低pH，能在柱适
应范围内较方便地进行。
2. 不同反离子（B-）对离子对提取常数（EAB）和ｋ＇的影响
不同的反离子所形成的离子对的提取常数是不同的，因此ｋ＇也不同。一般来讲，在正相IPC中，反离子的非极性部分越大（如季胺离子的烷基越大），则提取常数越大，ｋ＇就越小；而反相IPC中，反离子的非极性部分越大，ｋ＇也越大。
3. 改变流动相的种类和性质是提高分离选择性的重要途径 流动相中采用不同的有机溶剂，则EAB不同。
1、盐酸肾上腺素(Adrenaline; Epinephrine)
ChP:
填充剂：ODS；
流动相：0.14％庚烷磺酸钠溶液－甲 醇（65:35），用磷酸调节pH值至3.0±0.1； 检测波长:280nm。 理论板数应不低于3000。
盐酸吗啡 磷酸可待因
色谱柱：μ－BondapakC18流动相：甲醇-水（含有0.010mol/L磷酸盐缓冲溶液和0.015mol/L庚烷
磺酸钠，pH＝2.0）＝41：59
、联邦止咳露
通用名是“复方磷酸可待因溶液”，其有效成分为：每1ml含磷酸可待因1mg，盐酸麻黄碱0.8mg，马来酸氯苯那敏22mg。
辅料：色素、防腐剂、矫味剂
色谱条件：色谱柱: Spherisorb C18；10μm, 4.6mm³250mm；
流动相:甲醇-水-冰醋酸-己烷磺酸钠 (30∶66∶2∶2)； 流速: 0.8ml/min； 检测波长:256 nm ; 溶液配制：
供试品溶液的配制：精密量取联邦止咳露3 ml ,置10 ml 量瓶中,加醇3 ml ,加水稀释至刻度,摇匀,即得供试品溶液。
对照品溶液的配制:精密称取磷酸可待因对照品150 mg 和盐酸麻黄碱120 mg ,置同一个50 ml量瓶中,加甲醇使溶解并稀释至刻度,摇匀,即为贮备液。精密量取贮备液1 ml 置10 ml 量瓶中,加甲醇1 ml ,加水稀释至刻度,摇匀,即得对照品溶液。
第五节 分子筛色谱法（体积排阻色谱法）一、概述
溶质与固定相或流动相无相互作用的分离方式。
主要依据分子尺寸大小的差异来进行分离的方法，即固定相（多孔凝胶）能有效的进行分子量大小的分离。具有不同分子大小的样品通过柱时，溶质分子能够被柱填料的孔径分类。分析样品：多肽、蛋白质、多糖等生物大分子、高聚物
流动相为有机溶剂：凝胶渗透色谱（gel permeation chromatography，GPC）； 流动相为水：凝胶过滤色谱（gel filtration chromatography，GFC）
二、分离原理
大分子：大分子不能进入凝胶孔洞而被完全排除，只能沿着凝胶颗粒之间的空隙通过色谱柱，最先被流动相洗脱出来。
小分子：小分子能进入凝胶的绝大部分孔洞，在柱中收到更强的滞留，会更慢地被洗脱出来。
中等大小分子：中等大小分子只能进入凝胶中一些适当的孔洞中，但不能进入更小的微孔，所以在柱中受到的滞留作用介于大分子与小分子之间。溶剂分子：溶解样品的溶剂分子，分子量最小，可进入凝胶的所有孔洞，最后从柱中流出。
VR＝Vm+Kd²Vs
Kd
VRVm
Vs
溶质分子能够渗入填料内孔体积的分数：
胶的排阻极限。
当VR＝Vm，Kd＝0：说明溶质完全不进入凝胶内部，此现象称为全排斥，此也为凝当VR＝Vm+Vs，Kd＝1：说明溶质完全进入凝胶内部，此现象称为全渗透，此也为凝胶的渗透极限。
大部分溶质：0
优点：1）分离时间短，溶质谱带窄；2）
根据分子大小，可预测分离3）分离过程中无样品损耗和反应发生； 4）柱几乎不失活，寿命长；5）特别适用在未知样品的探索分离。
三、固定相
软质凝胶，不耐压（中、低压色谱）：葡聚糖凝胶聚丙烯酰胺凝胶琼脂糖凝胶半硬质凝胶：二乙烯基苯型凝胶硬质凝胶，耐压：多孔玻璃凝胶
四、流动相
1. 对样品的溶解性好
2. 由于高分子量样品的扩散系数小，应尽可能采用低粘度的溶剂 3. 与使用的凝胶固定相互相匹配 4. 与所使用的检测器相匹配
五、色谱柱的标定目的：用以测定分子量及分子量分布 方法：用一系列已知分子量的标样制作标定曲线。 举例：中国药典中测定多糖的分子量与分子量分布
1) 系统校正：根据供试品分子量的大小，选用5个已知分子量的多糖标准品（如葡聚糖）作标定曲线。
lgMw= a + b*tRMw：标样的已知重均分子量
2）样品测定取供试品溶液，进样，根据tR带入标定曲线，即可求出多糖的每个组分相应的分子量。
六、应用举例：头孢曲松钠中聚合物的检查
第六节 高效液相色谱仪及其操作
第七节
液相色谱仪的基本操作
1．开机前准备工作：过滤流动相；检查储液瓶中是否具有足够的流动相，吸液砂芯过
滤器是否已插入储液瓶底部；废液瓶是否已倒空，所有排液管是否已妥善插在废液瓶中。确定无误后，可开始操作。
2．开启稳压电源后，依次打开输液泵、柱温箱、检测器和色谱处理机电源。 3．在输液泵及检测器上设定所需要的流速、检测波长等参数。
4．排出管路气泡或冲洗管路：将排液阀旋转180°至open位置，按purge键，输液泵
以5 ml/min流量输液，观察输液泵中是否有气泡排出，确定管路中无气泡后，按purge键，使输液泵停止工作，再将排气阀旋钮旋转至close位置。
5．按pump键，设定输液泵以低流速（0.2-0.5 ml/min）泵出流动相，在此条件下接色谱
柱，接好后再将流速设定为所需要的流速。
6．待检测器预热一段时间后，打开色谱工作站，开始走基线。如基线不在合适位置，
可进行零点校正。待基线平稳后，可开始进样。
7．将六通进样阀旋转至LOAD位置，用平头注射器进样后，转回至INJECT位置，并
同时开始采集数据，色谱处理机自动记录色谱峰时间、峰面积，待色谱峰流出后，停止采样，对数据进行处理。
8．试验结束后，关闭输液泵、柱温箱、检测器和色谱处理机电源，关闭稳压电源，卸
下色谱柱，并及时按色谱柱说明书对色谱柱进行保养。 注意事项
1．新色谱柱或长期不用的色谱柱，应先用甲醇活化10-30 min后再使用。实验结束后用
纯甲醇冲洗管路及色谱柱一段时间，如用pH缓冲液做流动相时，应先用蒸馏水（含5%左右甲醇）冲洗30 min，再用纯甲醇冲洗。
2．微量注射器应使用平头的，亦防止刺穿进样阀的垫圈，应先用少量试样洗涤多次，
再慢慢抽入试样，并稍多于需要量（一般为2-3倍）。如内有气泡则将针头朝上，使气泡上升排出，再将过量的试样排出，用泸纸吸去针尖外所沾试样。注意切勿使针头内的试样流失。用完后用甲醇或丙酮洗涤数次。
3．流动相应先脱气方可使用。更换流动相时应停泵操作，以防止气泡进入，更换流动
向后，应先打开排液阀，按purge键排出先前的流动相。
4．输液泵应避免长时间在高压下（>30 Mpa）工作。如发现泵压过高，应立即停泵，检
查是否有堵塞或其它原因。
第四章 高效液相色谱法
第一节 概述
一、定义与分类
液相色谱是指流动相为液体的这类色谱法的总称。高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，简称HPLC），是一种在经典液相色谱基础上发展起来的实用、快速，高效及高灵敏度的分离分析方法。
根据固定相的不同，HPLC可分为以下几类：
1、 液－固吸附色谱法
2、 液－液分配色谱法
3、 化学键合相色谱法
4、 离子交换色谱法
5、 离子对色谱法
6、 凝胶色谱法（又称分子筛色谱法，分子排阻色谱法，尺寸排阻色谱法）
二、HPLC的特点和其它色谱法的比较
（一）与经典液相色谱比较
1、 高分离效能
H=A+B/u+Cu (A=2dp，C与dp2呈线性关系，dp↑→C↑，A↑)
经典柱色谱填料颗粒粒径一般大于100um，颗粒较大，传质扩散缓慢，手工装柱不易装均匀，涡流扩散现象较严重，因此经典液相色谱法柱效较低，分离能力差，只能胜任各组分分配系数相差较大的样品（各组分性质相差较大的样品）的分离，HPLC填料粒径一般为5-10μm，传质快，采用高压均浆技术装柱，装柱均匀性号，涡流扩散小，因此HPLC柱效很高，比经典柱色谱高数百～数千倍，25cm长的硅胶柱柱效可达2万理论塔板，能胜任复杂物的分离，峰容量大。
2、 快速，省时，省材料
经典柱色谱中的柱子多为一次性使用，且体积大（0.1～2m长，0.5～5cm粗），分离速度慢（几小时～几周），每次均要重新装柱，造成人力，物力及时间上的浪费，而一根HPLC柱能重复使用数百次，此外，由于配备了高压输液泵可实现快速分析。
3、 灵敏度高，准确度高，可达1％的分析精度
柱色谱及薄层色谱（TLC）在进行定量分析时影响因素较多，故准确度及重现性
均不如高效液相色谱。
HPLC与经典液相色谱的比较
（二）与GC比较
1、 适合于热不稳定性样品的分析
GC中使用气体为流动相，要求被测样品在气化室高温气化后方可在柱上分离，这就使得热不稳定性样品用
GC分析比较困难，需衍生化以保护被测物的不稳定基团
2、 有利于有机酸，碱等极性化合物的分离
这些物质用GC直接来测定时，由于有较大的极性，一方面易产生托尾的现象，另一方面，保留时间过长，因而测定困难，需利用衍生化来减小其极性后方可GC分析
3、 可分离离子型化合物及蛋白质，肽类等大分子化合物
这些物质无法气化，不可GC分析。
总之，HPLC与GC各有所长，互相补充，均成现代分析中不可缺少的工具。
第二节 液－固吸附色谱及液－液分配色谱
一 液－固吸附色谱（LSC）
(一) 定义
色谱分离是基于吸附效应的色谱法称为吸附色谱，又称液－固吸附色谱、正相色谱法（normal phase chromatography，NPC）。
液－固吸附色谱是最早出现的，也是最基本的一种柱色谱类型。在吸附色谱中，样品组分（溶质）受到两种力的作用，一是固定相对它的吸附力，二是流动相的“拉力”或溶解力，即溶质处于这两相作用力场的平衡之中。吸附力强而溶解能力差时，溶质有较大的保留；反之，则较先流出色谱柱。溶质，吸附剂和流动相溶剂分子三者间的相互作用，涉及偶极之间的诱导力，静电力，氢键力，色散力，电荷转移或∏络合物形成等相互作用类型。在氧化物型极性吸附型上，静电，诱导，氢键等特殊作用力为主要的作用力，色散力微不足道。但在非极性的固定相，例如多孔碳的情况下，非特殊的色散力是固定相与溶质分子间唯一的相互作用力。
（二）固定相
液—固吸附色谱固定相分类如下：
极性 极性吸附剂 酸性吸附剂： 硅胶、硅酸镁碱性吸附剂：氧化铝、氧化镁
非极性吸附剂：活性碳 薄壳型（表面多孔层）：优点：传质快，渗透性好； 缺点：比表面积小，样品容量小（
硅胶
结构
无定形 全多孔型（表面多孔层）：球 形 优点：比表面积大，样品容量大（mg/g） HPLC
中液—固吸附色谱固定相用的主要是硅胶。其次是氧化铝。结构类型主要采用薄壳型及全为多孔微粒型两种。
薄壳型及全为多孔微粒型硅胶的示意图
硅胶表面上的活性作用点：
液—固吸附色谱的保留机理：极性。极性小的组分先出峰（正相色谱）。
液—固吸附色谱样品的分离主要是因分子中的极性官能团与固定相表面上活性作用点（如硅醇基）之间的相互作用，这种极性相互作用的强弱归纳如下：
硅胶上各类化合物或官能团吸附强弱的分类
例如：环丙氟哌酸的中间体2，4—二氯氟苯的合成工艺如下：
Cl
NHAcClNHAcClClHO+ClNH2
(1)
(2) (3)
ClCl
NO2ClClF
(4) (5)
现对合成的最终产品2，4—二氯氟苯进行纯度检查。采用的检查方法为HPLC，以硅胶柱分析得到如下色谱。试判断图中各峰所对应的化合物（归属）。
⑤
④
① ③ 0min 20min
（三）流动相
LSC中使用的流动相为各种有机溶剂，主要为非极性的烃类（如己烷、庚烷），某些有机溶剂（如二氟甲烷、甲醇、二乙胺等）作为缓和剂加入其中以调节流动相的溶剂强度、极性及PH值，即进行所谓正相色谱、极性越大的组分保留时间越长。
1. 混合溶剂
液固色谱中广泛使用混合溶剂（二元、三元体系等），这是因为虽然不同的纯溶剂有不同的溶剂强度。但他们不一定是进行LSC的最佳溶剂强度。我们可以利用不同组成的混合溶剂获得任意需要的溶剂强度。
流动相主体：弱极性的戊烷、己烷、庚烷等。
改 性 剂：调节流动相的洗脱强度与峰形。
中等极性：二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯。
极性溶剂：四氢呋喃、乙腈、异丙醇、甲醇、水等。
碱性物质：如三乙胺等→分离碱性样品，避免峰拖尾或不可逆的保留。
2. 水的影响
硅胶及氧化铝为良好的干燥剂。水的含量对该类吸附剂的活度有很大的影响，即使有极微量的水吸附在其表面上，也会使吸附剂活性大大降低。
（四）液—固色谱的应用
随着HPLC技术的发展，虽然原来许多使用LSC模式的分离分析被更方便、稳定的化学键合相所代替，但在以下几个方面仍有其独特的意义：
1. 异构体的分离
许多异构体使用化学键合相来分离是不可能的或者是很困难的，而采用以硅胶为固定相的LSC却很容易分开。
2. 样品预处理
许多生物样品可使用经典LSC来进行纯化，除去蛋白质等干扰物，然后再进一步以GC或HPLC等分离分析。
3. 制备色谱
由于硅胶比较便易。所以进行分离比较有利，同时流动相为有机溶剂，容易挥发。便于产物提取。
4. 常用于HPLC-GC联用技术
由于流动相为有机溶剂，易于汽化，所以目前90%的HPLC-GC中的HPLC部分采用LSC，进行正相HPLC。
二、液-液分配色谱法（LLC）
（一）定义
色谱分离是基于样品组分在固定液和流动相之间分配的不同色谱法称为液-液分配色谱法。
这种方法的基本原理是物质在两种液相间的分配。它类似于实验中常用的液-液萃取法。其保留机理为溶解度。物质在固定液中的溶解度越大，保留时间越长。
（二）固定相
LLC的固定相为载体上涂渍的固定液。
1. 载体
原则上，所有多孔性的吸附材料均可作为固定液的载体。一般常用硅胶，硅藻土等。结构类型主要采用多孔层微珠及全多孔微粒型二种。多孔层微珠是较早使用的一种载体，它柱效好，分析时间短；但它的多孔层很薄，只能涂渍少量固定液（最大涂渍1~2%），故柱容量低，柱稳定性也差，因为少量的固定液流失将大大改变保留体积。全多孔微粒（如硅胶）孔容大（≈1ml/g），可涂渍较多的固定液，涂渍量可达1克固定液/每克载体（称为100%涂渍），其柱效比前者高，且柱容量高，柱子稳定性也好——载体上涂渍的固定液越多，则因固定液流失对样品保留体积的影响就越不显著，理想的载体应该具有如下特点：
1）孔容大
2）孔径应为100~500埃之间，孔径太小较大的分子可能被完全排阻，而保留时间更短，分离不佳。孔径太大，则固定液易流失，柱稳定性差，由于毛细管作用，固定液在小孔要比大孔内保持的好。
2. 固定液
固定液可采用气相色谱中常用的某些固定液，如不同聚合度的聚乙二醇、甲酰胺、丙撑二醇等。然而，对这些固定液，适合作为流动相的只有非极性链烃，最多再加入少量（最高10%）的氯仿，四氢呋喃和其他醚。所有常见的洗脱液都是这些固定液的良溶剂。但由于许多有机物样品在上述洗脱液中的溶解度很小，所以这类体系的适用性是有限的。
LLC的固定液的选择也可参考纸色谱法中使用的体系或从多组分中萃取已知组分的分配体系。如在纸色谱里，甾体药物可以在浸渍甲酰胺的纸上容易地分离，如果把甲酰胺涂在硅胶上，那么甾族化合物就能用高效液相色谱分离，因为甲酰胺即使在中等极性的溶剂苯、二氯甲烷中也几乎是不溶解的。
3.载体的涂渍
采用GC中常用的固定液涂渍方法。
（三）流动相
采用与固定液性质相差很大的不混溶的溶剂为流动相，流动相使用前需预先用固
定液饱和，或在分析柱前增加预饱和柱，以避免固定液流失。
（四）应用
LLC较适合于分离中等极性和极性物质，这些物质对LSC来说极性太高，LLC的应用范围几乎全被键合相色谱所包含，故现在已很少使用。
三、正相硅胶反相洗脱（NS/RE）色谱法
（一）固定相
本法采用未改性的原形硅胶为固定相，以水性溶液作流动相。常用于分析中药中的生物碱成分，或化学合成的生物碱类药物。
该方法的保留机制是基于硅胶表面的硅羟基在一定的条件下具有离子交换特性，改变任一流动相条件（pH, 离子强度，含水量），都会对保留时间产生影响。
（二）流动相
该法常用的流动相为：乙醇（或甲醇）—1~3%三乙胺水溶液（磷酸或醋酸调节pH值至6~7.5）（85：15）或（80：20）。该法的色谱保留机理相当于离子交换机理，主要依碱性强弱出峰。色谱峰的对称性很好，峰形尖锐。适合于分离在反相HPLC中不宜分离的生物碱类混合物（反相HPLC中生物碱可能拖尾及峰展宽，有时tR相差很大）。
影响NS/RE色谱保留的因素如下：
1. 水的比例增加，洗脱能力减小；
2. 三乙胺浓度升高，对含碱性基团组分的洗脱能力提高，保留时间缩短。流动相中三乙胺为阴离子竞争离子，用于竞争硅羟基，以消除硅羟基对生物间的吸附。
3. pH值对NS/RE的色谱保留具有两面性。一方面，增大pH值，硅醇基解离程度提高，离子交换特性增强，使保留时间增大。但另一方面，对于碱性化合物，增大pH会压制该化合物的解离，反而会使保留时间缩短。流动相的pH值以pH 6~7为好。原因有三：（1）pH太低，硅羟基失去离子交换能力。（2）pH值太高弱碱性药物不易离子化。
（3）pH值太高，硅叫在碱性溶液中有一定的溶解度。
4. 非解离型物质在该系统的出峰顺序类似于RP-HPLC（硅氧烷基疏水）
（三）柱子的培养
由于流动相中含有三乙胺，三乙胺吸附在硅羟基上。很难以甲醇清洗，所以每次做完样品，先以0.1%冰乙酸冲洗15-20min,洗去三乙胺，然后再用甲醇冲洗20min。经这样处理后，柱压可长期保持不变，达到保护柱子的目的。
第三节 化学键合相色谱
一、 意义和特点
化学键合相色谱使用的固定相是借助于化学反应的方法将有机分子以共价键连接在色谱担体上的，主要用于反相、正相、离子交换及离子对色谱中。据统计。键合相色谱在高效液相色谱的整个应用中占80%以上。
要形成化学键合固定相，有两个必要条件：一是所用的担体材料应有某种化学反应活性，如硅胶、氧化铝、硅藻土等表面都具有化学反应的官能团；但以硅胶为最理想的和最常用。二是有机分子应含有能与担体表面发生反应的官能团（详见下节讨论）。硅胶（SiO2·xH2O）之所以是理想的化学键合相担体，主要由它的表面性质所决定。硅胶表面硅原子主要以硅醇基（≡Si-OH）和硅氧烷形成存在，这种硅醇基是进行键合的活性官能团。
OH
Si OSiOSi
自由型硅醇基 硅氧烷型
按照晶体点阵计算，硅胶表面羟基数目可达到8个/nm2,但用化学方法测定的羟基数一般认为是约5个/nm2。硅胶表面存在着足够的可反应硅胶基，再加上硅胶本身的许多特点，例如强度好，孔结构和表面积易于人为控制，有较好的化学稳定性等，因而是各种化学键合相理想基质材料。
化学键合相在HPLC中的应用，引起了一场巨大的变革。使得较早出现的液-固吸附色谱及液-液分配色谱大量地被键合相色谱所取代，某些离子型的物质也从用传统的离子交换树脂分离改用离子交换键合相或反相离子对色谱分离。归纳起来，化学键合相主要有以下几个优越性。
1. 消除了担体上的表面活性作用点，清除了某些可能的催化活性。
这样就缓和了一些复杂样品在固定相表面上的不可逆化学吸附，使得操作简化，峰形对称；对溶剂中微量水分含量的变化要求不苛刻；此外，溶剂的残留效应小，梯度冲洗平衡快。这是键合相色谱在许多方面取代液固吸附色谱的主要原因。
2. 耐溶剂冲洗。
这是传统的液-液分配色谱（LLC）逐渐被键合相色谱取代的根本原因。LLC中
固定液的流失十分严重，为了克服这个缺点，曾采取溶剂预先用固定液饱和及柱前增加预饱和柱的方法，但这样做既不方便，柱系统的稳定性也差。化学键合相色谱的固定相永久性的键合在担体上，不会流失。
3. 热稳定性好
每种键合相均有其相应的最高使用温度，在此温度下可进行升温HPLC。如十八烷基键合相的流失温度在220℃以上。
4. 表面改性灵活，容易获得重复性产品
。改变键合用有机硅烷，可得到不同的键合相填料，以适用于各种类型的试样分离。控制硅胶的质量和键合工艺，可得到重复性产品。 二、制备和性能评价 （一）制备
在制备键合相时，首先作为担体的硅胶需要酸处理，使表面的硅氧烷键打开，形成尽可能多的自由羟基，有利于反应。
i
O
Si
OH
+
OHO
i
i
酸处理也可除去表面层的金属氧化物杂质和孔隙中的细粉。然后中和，在200℃以下烘干除去物理吸附水（不得超过200℃，否则硅醇基脱水形成硅氧烷结构），再以过量的硅烷化试剂进行化学键合。 （1）反应
键合反应的类型：Si-O-Si-C键型（硅胶与有机硅烷反应产物）
这是一类目前占绝对优势的键合相类型，具有良好的热稳定性及化学稳定性，能在pH 2～7.5的介质中使用。它是利用氯硅烷或烷氧基硅烷与硅胶反应而得。
CH3
OH
CH3
R
O
iCH3
R
X
CH3
X为Cl、CH3O或C2H5O。 R为辛烷基、十八烷基、苯基等。
如Bondapak-C18键合相，即为R = 十八烷基。
Si
OSi
OHOH
+X3SiR
Si
OSiO
O
SiRX
+ 3HX
X：-Cl、-OH、-OCH3、-OC2H5
R：-C8H17、-C18H37、-(CH2)nCN、-(CH2)nNH2
Si
OSi
OHOH
+X2SiRSi
OSiO
O
SiRR+ 2HX
Si
OH+XSiR3
SiOSiR + H
X
H3
H
+
X
(CH
2)17CH
3
bonding
(CH
2)17CH3
CH3
（2）端基封尾(endcap)－－消除残余的硅羟基
由于空间位阻的缘故，较大的硅烷分子不可能与担体表面上较小的硅醇基全部发生反应。因而残余羟基是不可避免的。为了进一步消除残留的游离硅醇基，一般在键合反应后再用一氯三甲基硅烷或六甲基二硅氨烷钝化。也可用十八烷基三氯硅烷再键合一次。
（3）常见的官能团
（4）常用的键合相商品牌号安捷伦公司（Agilent）：Zorbax Zorbax 由著名的色谱科学家Kickland研制，并由杜邦公司所生产和销售的系列色谱填料的注册商标。现在，Zorbax的全部生产线已并入Agilent公司。
Waters公司：Bondapak 、μ BondapakTM、XterraTMμ BondapakTM C18性能重现性非常好。能经历20多年但性能基本上保持一致的HPLC并不多， μ BondapakTM C18是其中一个代表性的品种。
瑞典Akzo Nobel公司：Kromasil ：Kromasil 硅胶的质量较稳定，但柱压较高。 Merck公司：LiChrosorb、LiChrospher、Nucleosil
（二）化学键合相性能评价
由于各种键合相均以硅胶为基质，可以认为是一种改性硅胶。在化学键合相色谱中，代表色谱保留ｋ＇是与键合在硅胶表面有机基团的覆盖量直接有关，因而键合相表面改性的完全程度和重现性是色谱用户和制造厂家共同关心的。重复性和改性完全程度可通过残余羟基，覆盖度和覆盖均匀性表示。测定和评价的方法有微量元素分析、色谱、光谱、核磁共振法等。
１． 微量元素分析或热失重法 本法直接测定键合相的碳含量：C%
键合相中C的重量
担体的重量
100%
这个值在２～２９％之间变化。由于Ｃ％随基质比表面积（Ｓ）和键合有机基团的分子量（Ｍ）变换，所以在研究和比较的工作中采用表面键合相浓度α表示，即单位表面积所含键合相的浓度(umol/m2)：
=
WMS
式中，w为1g担体上键合有机物的重量（μg）；M为键合有机基团的分子量；S为担体比表面积（m2/g）。
W用碳含量表示： W=
C%12Nc
M10
6
式中，12为碳的原子量；Nc为键合有机基团的碳数。 有时也用表面覆盖度表示键合量。 表面覆盖度=
单位表面键合有机基团单位表面含有可反应硅
的微摩尔数醇基的微摩尔数
=
510
1817
=
8.3
6.0210
这里假定硅胶表面可反应的硅胶基数目为5个/nm2，6.02³1017为以微摩尔为基准的阿佛加德罗常数。
2. 色谱法
键合相的性能用色谱方法评价是很自然的，因为它最终用于色谱，所以生产厂家一般都给出产品附上特定标准物苯及联苯的保留值和柱效率，或者其它参数的测试结果。例如对反相填料在甲醇-水条件下考察对芳烃、苯、萘、联苯的分离情况。也有人提出用非极性键合相填料正相洗脱的方法检查残余羟基的含量，即用庚烷作流动相。若残余羟基甚少，则象甲醇、丙酮等极性化合物的保留时间与tm相近。且峰形对称。
若残余羟基甚多。则情况相反。这种方法评价较为多客观。
3. 光谱法
光谱法也是考察填料表面羟基含量的重要手段。这是基于Si-OH基在3750cm-1
处有特征的红外吸收谱带，借此可以获得某些信息。 三、 分类
化学键合相的分类可以有不同的依据。按键合相的表面结构分为单分子键合和聚合键合；按键合有机硅烷的官能团分为极性键合相、非极性键和离子交换键合相三种。 四．极性键合相色谱
极性键合相指键合有机分子中含有某种极性基团。和空白硅胶相比，这种极性键合相的表面能分布相对均匀，因而吸附活性比硅胶低，可以看成是一种改性过的硅胶。最常见的极性键合相有氰基（-CN，Cyano-）、二醇基（diol）、氨基（-NH2，amino-）等。商品键合相一般均以上述基团命名，如Lichrosorb NH2，u-Bondapak CN等。也有的商品键合相并不注明是什么基团。
对于极性键合相来讲，一般键合表面由三部分组成：键型、主体基团、极性端基。
键型：如Si-O-Si-C。它是整个极性键合基团与硅胶母体直接相连的桥梁。 主体基团：一般由直键烃基或醚基所组成，其作用为使硅胶表面与特定的极性基团之间保持一定距离。
极性端基：由带极性基团（如NH2，ＯＨ）的烃基或芳基组成。
大多数情况下，极性键合相的制备分三步进行。第一步是在硅胶表面先接一个正烃基或正芳基硅烷，然后再以相应的取代反应引入极性基团。由于空间位阻的影响，上述反应不能象相似相溶液那样完全，一般靠碳和氮含量来计算表面覆盖程度。
上述三种极性键合相都是一氢键力作用，其中氰基是一种氢键接受体，而后两种兼具氢键接受体和给予体两种性能。对于有较强氢键作用力的样品，在后两种键合相上的保留值大，所得ｋ＇值也大。
极性键合相一般都用作正相色谱，即用非极性或极性小的溶剂（如烃类溶剂）加
入适量的极性溶剂（如氯仿、醇类、乙腈等），以调节控制洗脱液的洗脱强度。分离组分的出峰顺序与组分的极性大小顺序相同，即极性弱的先出峰，极性强的后出峰。但对强极性的化合物，上述极性键合相也可用反相色谱，如分离糖类或多肽化合物时，用乙腈-水作洗脱液也可以得到良好的分离效果。
极性键合相的保留机理既有吸附的因素，也有分配的因素。一般认为吸附过程是主要的相互作用过程，通过填料表面极性基团的偶极诱导，或氢键，或静电作用和溶质分子发生相互作用，达到分离目的。
极性键合相色谱提纲：
1、键合表面的基团组成键型：Si-O-Si-C或Si-O-Si-N
主体基团：直链烃基或醚基极性的端基：氨基（-NH2）、氰基（-CN）、二醇基（diol）、芳硝基、醚基
LiChrosorb NH2、 LiChrosorb Diol2、分离机理作用力：氢键力氰
基：氢键接受体
氨基、二醇基：氢键接受体与给予体
联苯胺、苯胺k’:氨基>氰基（学生思考原因）
3、色谱分离方式1）一般用作正相色谱流动相：弱极性溶剂 ＋ 适量极性溶剂 （烃类） （氯仿、醇、乙腈）溶质保留规律：
A 溶质的分离是基于亲水结构的差异； B 溶质的极性越大，保留值越大； C 流动相极性越大，洗脱强度越大。 2）也用作反相色谱
分离样品：强极性化合物，如糖类、多肽
五．离子交换键合相色谱
离子交换色谱早期都采用高分子聚合物（如聚苯乙烯树脂）为基质的离子交换树脂作用定相。在HPLC中，这种固定相由于溶胀性，不耐高压，以及表面的微孔型结构影响传质速率，现已被离子交换键合相所代替。
在化学键合的有机硅烷分子中带上固定的离子交换基团，便成了离子交换键合相。若带上磺酸基(-SO3), 羧酸基（-COOH），就是阳离子交换剂，若带上季氨基（-R4N+）或氨基（-NH4）就是阳离子交换剂。
离子交换键合相多以薄壳型或全多孔微粒硅胶为基质，具有较高的耐压性，化学及热稳定性。由于有较好的机械强度，耐压，这类微粒型键合相可以高压匀浆装柱。但它们的pH适用范围只能在pH 2~8。pH＞9时，硅胶便容易溶解。特别是未键合的残留硅羟基容易生成硅酸盐。
离子交换容量是很重要的。交换容量越大，负载能力越大，ｋ＇值也越大。离子交换键合相的交换容量与固定相的表面积直接有关。全多孔微粒型固定相的交换容量较大，一般为毫克当量水平（0.2~0.5毫克当量/克）；薄壳型由于表面积较小，一般只有微克当量级（30~60微克当量/克）。交换容量可用酸碱滴定法测定。
在离子交换键合相色谱中，离子交换键合相色谱的流动相多为控制一定的pH的缓冲液。流动相中往往加入有机成分作为改性剂。溶质的保留值受流动相的pH值、离子强度以及有机改性剂的影响，溶质的保留兼有离子交换和吸附双重机理。
1. pH值对保留时间的影响
弱酸及弱碱的保留值
与洗脱液的pH值有关，它们或者先解离并参加离子交换而被分离；或者不解离。不参加离子交换，而以分子形式几乎无保留地通
过柱子（实际上由于极性基团微弱的吸附作用而产生很小的保留作用）。
在强阴离子交换键合
PH
相上分离弱酸性有机阴离子时，当pH过高（如pH＞7时），有机酸完全电离，牢固地吸附在固定相上，ｋ＇很大，难于洗脱，此时便于无分离作用。又如在阳离子交换键合相（-SO3H）上分离碱性药物时，当pH过高，固定相转变成钠型（-SO3-+Na），碱性药物以游离碱形式存在，无交换能力，ｋ＇很小。也无法达到分离目的。例如，在分离腺嘌呤及胞嘧啶时以正丁基磺酸（键合在硅胶上）作为固定相，采用0.1mol/L的磷酸盐缓冲液（pH2.5~7.5）作为洗脱液。不同的pH对ｋ＇的影响见图1。pH大于6时，两碱性样品的ｋ＇都在1~1.5之间，在这样的pH下，交换集团完全是以Na+的形式存在的，而游离的胞嘧啶及腺嘌呤无法与Na+离子交换。当pH值减小时，碱性样品的ｋ＇值增加。在低pH值得情况下，ｋ＇重新与pH无关，因为这时碱完全被质子化而牢固地吸附在固定相上，ｋ＇很大，不易洗脱。曲线的转折点近似相当于两碱性药物的pkb值，在这种情况下，碱与它们的盐以1：1的比例平衡。
由上述可见流动相的pH选择应适中，最好选择在被分离的酸或碱的pka或pkb附近，使它们解离适中，达到最佳分离。
为提高分离度，可采用不同pH的缓冲液作为梯度淋洗，通过选择适当的洗脱条件，可以得到很好的分离效果。如在分离有机酸混合物时，随着pH值得减低，酸性弱（pka较大）的组分先洗脱出，然后再降低pH，酸性较强（pka较小）的组分也被洗脱出来。
（1）在用强阴离子交换键合相分离酸性药物时，pH↑→药物解离度↑→ｋ＇↑，保留时间↑。
（2）在用强阳离子交换键合相分离碱性药物时，pH↑→游离碱↑→ｋ＇↓，保留时间↓。
2. 离子强度对保留值得影响
离子强度（缓冲盐浓度）增加，ｋ＇减小。如图2，在前述固定相分离腺嘌呤及胞嘧啶时，ｋ＇随NaH2PO4盐浓度的变大而减小，成反比。原因归结于离子交换平衡的移动。
3. 有机改性剂对保留的影响
如果洗脱液中加入极性有机组分（如乙醇），则抑制离子交换，并且产生按分配机理进行的分离。
六、非极性键合相色谱（Non-polar bonded phase chromatography）
又称反相键合相色谱（Reversed phase chromatography）, 这主要是因为所用的键合固定相表面都是极性很小的烃基，如十八烷基、辛烷基、甲基、苯基等，而洗脱液大都采用强极性溶剂（水、醇、乙腈）或无机盐的缓冲液。在这种键合相色谱中，洗脱次序恰与正相色谱相反，即极性大的化合物先洗脱（ｋ＇小），极性小的化合物不易洗脱（ｋ＇大）。该类键合相中最常用的是十八烷基硅烷键合硅胶，又称ODS。 （一）反相键合相色谱的分离机理
1．疏溶剂作用理论（Solvophobic interaction）
当一个溶质分子的非极性部分与极性溶剂接触时，相互产生斥力。这种效应称为“憎水”或“疏溶剂效应”。当溶质进入到极性流动相中时，分子中的非极性部分总是趋向与其它非极性部分聚集在一起，以减少与极性溶剂接触的面积．而使体系的能量最低。图中黑箭头表示疏溶剂力，空心箭头表示溶质分子与极性溶剂的作用力。
疏溶剂作用理论以解释单分子层键合相的色谱保留机理：该理论认为非极性烷基键合相是在硅胶表面蒙覆了一层以Si-C键化学键合的十八烷基（或其他烃基）的“分子毛”。
这种构成“分子毛”的长键烃基具有强的疏水特性。对于一个被分离的有机化合物来讲，可把整个分子看成是非极性部分和极性官能团部分所组成。溶质分子与键合相表面的烷基之间的疏溶剂作用是溶质分子S与键合烷基L间的一种可逆缔合作用。
S + L
LS
缔合作用强度和溶质的色谱保留值取决于以下三个因素： （1） 溶质分子中非极性部分的总表面积； （2） 键合相上烷基的总表面积； （3） 洗脱液的表面张力
（1） 溶质分子中的非极性部分总表面积越大，缔合作用越强。
在一定的洗脱液和温度下，logｋ＇与该总表面积成正比。但如分子中非极性部分相同，而增加极性基团，则因为增加了溶质分子与洗脱液的极性分子间的作用力而使ｋ＇减小。
（2）logｋ＇与键合相表面烷基的总表面积也成线性关系，烷基越大，ｋ＇越大。
烷基数量越多，溶质保留越强。 烷基碳链越长，溶质保留越强
图2为几种酚类化合物在不同长短碳链的非极性键和相上所得logｋ＇比较，OH数越多，ｋ＇越小，键合相链长越长，ｋ＇越大。
logk’
OH
OH
HO
OH
OH
图2溶质极性，键合相链长与logｋ＇关系
（2） 洗脱液的表面张力也是影响ｋ＇的重要因素。表面张力越大，则S与L缔合时
释放的能量越多，ｋ＇也越大。
洗脱液中极性有机溶剂增加。其表面张力就越小，ｋ＇也随之减小，如果把电解质（如缓冲液或中性盐）加入到洗脱液，则表面张力随着盐浓度的增加而增加，ｋ＇也就越大。这也是反相键合相的选择原则。如醇-水洗脱液中增加醇的比例ｋ＇就减小，增加水的比例ｋ＇就增加。加入无机盐ｋ＇增加。
2．双保留机理
烷基键合相表面往往还有残余硅醇基，这是一种微量酸性的基团，可与溶质阳离子或氢键基团相互作用，这种作用叫做“亲硅醇基效应”（Silanophilic interaction）。双保留机理认为溶质的保留值应包括两部分的贡献，即疏溶剂效应和亲硅醇基效应。
色谱中的双保留机理往往导致一些不利的影响，如柱效低，峰形拖尾等。为了克服这个缺点，在一些特定的场合下，例如进行碱性化合物的分离时，往往向流动相中加入某种胺类添加剂，让游离的-NH2基与残余Si-OH首先作用，从而掩盖了溶质分子与键合相的亲硅醇基效应。
（二）流动相
反相HPLC的流动相一般选择（1）甲醇—水及（2）乙腈—水两种系统。此外，还可考（3）四氢呋喃—水。
系统（2）较系统（1）好，原因如下：
A) 系统（2）的粘度较系统（1）小，柱效好些。
（注：粘度↑→ 柱压↑，传质阻力↑（溶质扩散阻力↑）→ 柱效↓） B) 乙腈的紫外末端吸收较甲醇小，在低波长处测定时，基线波动较甲醇小，测
定误差小。
1．对于中性药物而言
（1）待测物极性较大时，则选择：水相比例较大。
甲醇—水，乙腈—水的常用比率为（20-35：80-65）。即（20：80）—（35：65）
例1. 柴胡皂甙C（Saikosaponin C）
O
CH2OH
OOHOOHOH
OO
OH
O
CH2
OOH
O
OH
CH3OHO
H
色谱柱：YWG ODS A-311 (6.0 mm, I.D.³10 cm) 流动相：乙腈：水（28：72）
流速：3 ml/min 检测波长：203 nm
例2. 栀子甙（Geniposide）
CH3
色谱柱：Spheri-5 RP-18, 5m (4.0 mm, I.D.³25 cm) 流动相：甲醇：水（35：65）
流速：0.8 ml/min
检测波长：240 nm tR：7.77 min
（2）当待测物的极性较小时，则选择：有机相比例较大。
甲醇—水，乙腈—水的常用比率为（60-80：40-20）。即（60：40）—（80：20） 例：醋酸甲羟孕酮（Medroxyprogesterone acetate）
COCH3
3
色谱柱：Hypersil ODS (4.6 mm, I.D.³25 cm) 流动相：甲醇：水（70：30）
检测波长：240 nm tR：7.3 min
2．对于碱性药物而言
由于“亲硅醇基效应”，固定相上残余的硅醇基往往使生物碱峰拖尾或被吸附。解决办法如下：
（1）向流动相中加入胺类添加剂—作为扫尾剂，同时又起到离子抑制的作用。 如：三乙胺（0.05 %），二乙胺（0.0125 %），正丁胺（10mmol/L） 例：替诺昔康（Tenoxicam）—西药：非甾体抗炎药。解热、镇痛、消炎。
在甲醇—水的系统中，该药出现明显的拖尾现象，加入少量的三乙胺作为扫尾剂，峰形改善。
O
OH
N
色谱柱：Spherisob C18, 5m (4.6 mm, I.D.³15 cm) 流动相：甲醇：水：三乙胺（18：86：0.05）
流速：1 ml/min 检测波长：361 nm
（2）加入反离子，利用离子对色谱来解决。（Pair ion Chromatography, PIC） 常用离子对试剂：烷基磺酸盐。如：正戊磺酸钠（PIC-B5），正己磺酸钠（PIC-B6），正庚磺酸钠（PIC-B7），正辛磺酸钠（PIC-B8），十二烷基磺酸钠（SDS）。
在相同的色谱条件下，反离子的烷基增加一个碳将使保留时间延长很多。十二烷基硫酸钠有时使保留时间过长，此时可换低碳烷基的离子对试剂，如庚基磺酸钠（PIC-B7）或辛基磺酸钠（PIC-B8）等。
流动相配制：
在甲醇—水（或乙腈—水）系统中加入PIC试剂（市售为浓溶液）使其浓度为3-10 mmol/L,并以磷酸二氢钾及磷酸调节流动相至适当的pH值。 用离子对色谱法分离测定碱性药物时，流动相pH=3-3.5即可。 例1. 左卡尼汀（Levocarnitine）
OH
CH3CH3CHN
CH2
C
CH2
COO
H
色谱柱：Hypersil ODS, 5m (4.6 mm, I.D.³20 cm)
流动相：以含有2.8 mmol/L庚烷磺酸钠的0.05 mol/L磷酸盐缓冲液（取11.5 ml磷酸至1900 ml水中，用1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH值为2.4，每98 ml上述溶液中加入55.5 mg庚烷磺酸钠，摇匀）—甲醇（98：2）
流速：1 ml/min 检测波长：225 nm tR：7.5 min
例2. 盐酸苯乙双胍（Phenformin Hydrochloride）
流动相：甲醇：水（1：1），含0.02 %冰乙酸和5 mol/L庚烷磺酸钠（pH 3.7）
（3）pH控制离子化以控制保留
低pH值可加快碱性化合物出峰，并抑制“亲硅醇基效应”。 例：止咳化痰丸重麻黄碱及伪麻黄碱的测定 色谱柱： ODS, 10 m (3.9 mm, I.D.³30 cm)
流动相：0.01 mol/L磷酸氢二钾（用磷酸调至pH 2.5）— 甲醇（96：4）。
3．对于酸性待测物而言
先用甲醇—水，乙腈—水两种系统。很多酸性药物能用这两种系统进行分离分析。 例：厚朴酚（Magnobol）
色谱柱：YWG ODS 10 m (4.6 mm, I.D.³25 cm) 流动相：甲醇：水（75：25）
流速：1 ml/min 检测波长：294 nm tR：9.6 min
当甲醇—水，乙腈—水，四氢呋喃—水系统不行时，可考虑以下办法。
（1）离子抑制色谱法（Ion Suppression Chromatography）：
通过调节流动相的pH值，抑制组分的解离，增加它在固定相中的溶解度，以达到分离目的。
（1） 适用范围：
适合于3.0≦ pKa ≦7.0的弱酸。
对于pKa
（2） 抑制剂：
通过向流动相中加入少量弱酸（常用醋酸）或缓冲盐（常用磷酸盐急促酸盐）为抑制剂，调节pH，抑制组分解离，增加中性分子存在几率。对于酸性药物，pH小于pKa时，药物多数以分子形式存在。pH ↓→ k↑,tR ↑ 离子抑制色谱中流动相的pH需在2-7.8之间，以防键合相脱落。 分析酸性药物时，常在流动相中加入0.3-2%的冰醋酸。
例1：血样中二氟尼柳（diflunisal）
COOH
F
F
OH
色谱柱：Spherisorb C18 5 m (4.5 mm, I.D.³25 cm) 流动相：甲醇：水：冰醋酸（66：30：1） 例2：血样中醋氯芬酸（aceclofenac）
l
NHCl
CH2COOCH2COOH
色谱柱：Spherisorb C18 5 m (4.0 mm, I.D.³15 cm) 流动相：甲醇：水：冰醋酸（65：35：2） （2）离子对色谱
对酸性药物：流动相pH≈7.5
常用离子对试剂：四丁基季铵盐（PIC-A）
四丁基胺磷酸盐（TBA等）
例1：蒽环类抗生素（8种）
O
O
H
2OH
R1OOH
色谱柱： Bondapak C18 (4.6 mm, I.D.³30cm)
流动相：甲醇：水(含10mmol/L四丁基磷酸盐)（65：35）
流速：1 ml/min
（三） 反相HPLC分析酸性和碱性药物时的常见问题及解决方法
1、分析碱性药物时会遇见的常见问题及解决方法：
常见问题：（1）拖尾或不出峰（亲硅醇基效应所致） 解决方法：（a）流动相中添加小分子有机胺
（b）离子对技术 （c）缓冲液
（2）峰裂分或多重峰（二次化学平衡所致） 解决方法：（a）流动相溶样后再进样 （b）调整进样溶液的pH值。 2、分析酸性药物时会遇见的常见问题及解决方法：
常见问题：（1）峰形拖尾或不对称（主要由待测物离子化所致）
解决方法：调整流动相pH值至酸性或加入酸性缓冲液进行
离子抑制。
（2）峰裂分或多重峰（二次化学平衡所致） 解决方法：（a）流动相溶样后再进样 （b）调整进样溶液的pH值。
第四节 离子对色谱（Ion-pair chromatography, IPC）
一、基本原理
定义：离子对色谱是通过加入合适的反离子（Counter ion）与离子化的试剂形成离子对，这种离子对类同中性或非极性分子一样，从而可采用分配色谱的方法进行分离的一种色谱分离分析方法。
离子对的形成： 试样离子+反离子
±
±
（试样离子反离子试样离子（以A表示）和反离子
±
（以B±表示）均溶于水相，而组成的离子对复合物（以A±·B±表示）易溶于有机相中，可表示为（设试样离子为A±）
Aaq+ + Baq-（A+·B-）org
这一平衡的平衡常数即提取常数，可表示为EAB。
EAB =
[AB]org[A]aq[B]aq
1. 在正相离子对色谱中
流动相中被测样品离子A+与固定相或流动相中带相反电荷的平衡离子（反离子）B-相结合，生成离子对化合物A·B，然后在两相之间进行分配分离。A+在两相之间的分配系数KA为：
KA=
[A]aq[AB]aq
1EAB[B]aq
容量因子ｋ＇KA
讨论： a) 反离子浓度[B-]aq↑
b) AB易被有机相萃取
VsVm
Vs
EAB[B]aqVm
ｋ＇↓，保留时间↓； EAB↑
ｋ＇↓，保留时间↓
相流动相
离子对色谱分离过
程示意图
反相
正相
2.在反相离子对色谱中
固定相为疏水性的键合相（如ODS），被分离的离子A+和反离子B-同时存在于强极性的流动相中，生成的离子对复合物AB在流动相和键合相中进行分配分离，其分配系数和容量因子ｋ＇为：
KA
[AB]org[A]aqVsVm
EAB[B]aq
ｋ＇KA
讨论： a) 增加反离子浓度[B-]aq↑
b) AB易被有机相萃取
EAB[B]aq
VsVn
ｋ＇↑，保留时间↑；
ｋ＇↑，保留时间↑
EAB↑
然而，无论在正相还是反相离子对色谱中。当[B-]aq增大到一定浓度时，样品离子基本上都已转化成离子对AB（不可能100%转化），于是ｋ＇基本保持不变。为了使ｋ＇有合适的数值，即保持ｋ＇在1~10之间，关键是选择合适的反离子种类和浓度。ｋ＇太大，分析时间过长；ｋ＇太小，则分离不开。
离子对色谱保留机理的解释尚有争论，上述假设只是一种离子对模式，除此之外还有动力学离子交换模式和离子相互作用机理。 二、基本方法
1. 正相离子对色谱
采用硅胶、硅藻土或纤维素为担体，合适pH的以一定浓度溶于水或缓冲液的反离子涂于担体上。流动相为弱极性的与水不相容有机溶剂（如氯仿，二氯甲烷等）。有时加入5~10%的亲脂性醇改善峰形。样品溶于有机溶剂或含有反离子的意有机溶剂后进样。（A+·B-）离子对存在于流动相中，可通过不同的反离子改善检测。如使用萘-乙-磺
H
O2N
NO2
酸或苦味酸（
NO2
）为反离子时，能使没有紫外吸收的物质也能被检测。
正相离子对色谱中的反离子是加在固定相中的。色谱过程中要消耗反离子而使色谱系统不稳定，所以在应用上受到限制。
2. 反相离子对色谱
固定相为化学键合相的非极性表面，尤以ODS（C18）及C8反相柱最适宜，流动相同RPHPLC一样，常用甲醇-水，乙腈-水。反相离子对色谱系统稳定，且不存在固定液流失问题。ｋ＇的调节也很方便，可随时改变反离子浓度及pH等。此外，还适宜于梯度洗脱。所以反相离子对色谱乙获得广泛的应用。 三、影响分离的因素
1. pH的影响
合适的pH是离子对色谱的重要条件，它将决定离子型化合物的解离度，为了有最大的保留和响应，希望有最大的解离，但又不能超出柱子所能承受的范围，一般pH为2~7.5，最多不超过9。
分离强酸性药物，pH低也能充分解离，故对pH要求不严；对于弱酸性药物，如磺胺类，巴比妥类药物等，需在pH高时才能充分解离，若pH低，含抑制解离，样品组分呈不解离溶质，则按一般色谱进行。碱性试样的分析可控制在较低pH，能在柱适
应范围内较方便地进行。
2. 不同反离子（B-）对离子对提取常数（EAB）和ｋ＇的影响
不同的反离子所形成的离子对的提取常数是不同的，因此ｋ＇也不同。一般来讲，在正相IPC中，反离子的非极性部分越大（如季胺离子的烷基越大），则提取常数越大，ｋ＇就越小；而反相IPC中，反离子的非极性部分越大，ｋ＇也越大。
3. 改变流动相的种类和性质是提高分离选择性的重要途径 流动相中采用不同的有机溶剂，则EAB不同。
1、盐酸肾上腺素(Adrenaline; Epinephrine)
ChP:
填充剂：ODS；
流动相：0.14％庚烷磺酸钠溶液－甲 醇（65:35），用磷酸调节pH值至3.0±0.1； 检测波长:280nm。 理论板数应不低于3000。
盐酸吗啡 磷酸可待因
色谱柱：μ－BondapakC18流动相：甲醇-水（含有0.010mol/L磷酸盐缓冲溶液和0.015mol/L庚烷
磺酸钠，pH＝2.0）＝41：59
、联邦止咳露
通用名是“复方磷酸可待因溶液”，其有效成分为：每1ml含磷酸可待因1mg，盐酸麻黄碱0.8mg，马来酸氯苯那敏22mg。
辅料：色素、防腐剂、矫味剂
色谱条件：色谱柱: Spherisorb C18；10μm, 4.6mm³250mm；
流动相:甲醇-水-冰醋酸-己烷磺酸钠 (30∶66∶2∶2)； 流速: 0.8ml/min； 检测波长:256 nm ; 溶液配制：
供试品溶液的配制：精密量取联邦止咳露3 ml ,置10 ml 量瓶中,加醇3 ml ,加水稀释至刻度,摇匀,即得供试品溶液。
对照品溶液的配制:精密称取磷酸可待因对照品150 mg 和盐酸麻黄碱120 mg ,置同一个50 ml量瓶中,加甲醇使溶解并稀释至刻度,摇匀,即为贮备液。精密量取贮备液1 ml 置10 ml 量瓶中,加甲醇1 ml ,加水稀释至刻度,摇匀,即得对照品溶液。
第五节 分子筛色谱法（体积排阻色谱法）一、概述
溶质与固定相或流动相无相互作用的分离方式。
主要依据分子尺寸大小的差异来进行分离的方法，即固定相（多孔凝胶）能有效的进行分子量大小的分离。具有不同分子大小的样品通过柱时，溶质分子能够被柱填料的孔径分类。分析样品：多肽、蛋白质、多糖等生物大分子、高聚物
流动相为有机溶剂：凝胶渗透色谱（gel permeation chromatography，GPC）； 流动相为水：凝胶过滤色谱（gel filtration chromatography，GFC）
二、分离原理
大分子：大分子不能进入凝胶孔洞而被完全排除，只能沿着凝胶颗粒之间的空隙通过色谱柱，最先被流动相洗脱出来。
小分子：小分子能进入凝胶的绝大部分孔洞，在柱中收到更强的滞留，会更慢地被洗脱出来。
中等大小分子：中等大小分子只能进入凝胶中一些适当的孔洞中，但不能进入更小的微孔，所以在柱中受到的滞留作用介于大分子与小分子之间。溶剂分子：溶解样品的溶剂分子，分子量最小，可进入凝胶的所有孔洞，最后从柱中流出。
VR＝Vm+Kd²Vs
Kd
VRVm
Vs
溶质分子能够渗入填料内孔体积的分数：
胶的排阻极限。
当VR＝Vm，Kd＝0：说明溶质完全不进入凝胶内部，此现象称为全排斥，此也为凝当VR＝Vm+Vs，Kd＝1：说明溶质完全进入凝胶内部，此现象称为全渗透，此也为凝胶的渗透极限。
大部分溶质：0
优点：1）分离时间短，溶质谱带窄；2）
根据分子大小，可预测分离3）分离过程中无样品损耗和反应发生； 4）柱几乎不失活，寿命长；5）特别适用在未知样品的探索分离。
三、固定相
软质凝胶，不耐压（中、低压色谱）：葡聚糖凝胶聚丙烯酰胺凝胶琼脂糖凝胶半硬质凝胶：二乙烯基苯型凝胶硬质凝胶，耐压：多孔玻璃凝胶
四、流动相
1. 对样品的溶解性好
2. 由于高分子量样品的扩散系数小，应尽可能采用低粘度的溶剂 3. 与使用的凝胶固定相互相匹配 4. 与所使用的检测器相匹配
五、色谱柱的标定目的：用以测定分子量及分子量分布 方法：用一系列已知分子量的标样制作标定曲线。 举例：中国药典中测定多糖的分子量与分子量分布
1) 系统校正：根据供试品分子量的大小，选用5个已知分子量的多糖标准品（如葡聚糖）作标定曲线。
lgMw= a + b*tRMw：标样的已知重均分子量
2）样品测定取供试品溶液，进样，根据tR带入标定曲线，即可求出多糖的每个组分相应的分子量。
六、应用举例：头孢曲松钠中聚合物的检查
第六节 高效液相色谱仪及其操作
第七节
液相色谱仪的基本操作
1．开机前准备工作：过滤流动相；检查储液瓶中是否具有足够的流动相，吸液砂芯过
滤器是否已插入储液瓶底部；废液瓶是否已倒空，所有排液管是否已妥善插在废液瓶中。确定无误后，可开始操作。
2．开启稳压电源后，依次打开输液泵、柱温箱、检测器和色谱处理机电源。 3．在输液泵及检测器上设定所需要的流速、检测波长等参数。
4．排出管路气泡或冲洗管路：将排液阀旋转180°至open位置，按purge键，输液泵
以5 ml/min流量输液，观察输液泵中是否有气泡排出，确定管路中无气泡后，按purge键，使输液泵停止工作，再将排气阀旋钮旋转至close位置。
5．按pump键，设定输液泵以低流速（0.2-0.5 ml/min）泵出流动相，在此条件下接色谱
柱，接好后再将流速设定为所需要的流速。
6．待检测器预热一段时间后，打开色谱工作站，开始走基线。如基线不在合适位置，
可进行零点校正。待基线平稳后，可开始进样。
7．将六通进样阀旋转至LOAD位置，用平头注射器进样后，转回至INJECT位置，并
同时开始采集数据，色谱处理机自动记录色谱峰时间、峰面积，待色谱峰流出后，停止采样，对数据进行处理。
8．试验结束后，关闭输液泵、柱温箱、检测器和色谱处理机电源，关闭稳压电源，卸
下色谱柱，并及时按色谱柱说明书对色谱柱进行保养。 注意事项
1．新色谱柱或长期不用的色谱柱，应先用甲醇活化10-30 min后再使用。实验结束后用
纯甲醇冲洗管路及色谱柱一段时间，如用pH缓冲液做流动相时，应先用蒸馏水（含5%左右甲醇）冲洗30 min，再用纯甲醇冲洗。
2．微量注射器应使用平头的，亦防止刺穿进样阀的垫圈，应先用少量试样洗涤多次，
再慢慢抽入试样，并稍多于需要量（一般为2-3倍）。如内有气泡则将针头朝上，使气泡上升排出，再将过量的试样排出，用泸纸吸去针尖外所沾试样。注意切勿使针头内的试样流失。用完后用甲醇或丙酮洗涤数次。
3．流动相应先脱气方可使用。更换流动相时应停泵操作，以防止气泡进入，更换流动
向后，应先打开排液阀，按purge键排出先前的流动相。
4．输液泵应避免长时间在高压下（>30 Mpa）工作。如发现泵压过高，应立即停泵，检
查是否有堵塞或其它原因。