第21卷4期 中 国 病 毒 学 21（4）：343-347
收稿日期：2006-01-20，修回日期：2006-02-27
* 基金项目：中国农业大学优秀人才引进基金资助项目。
作者简介：赵 琳（1979-），女， 内蒙古籍，硕士，分子免疫学研究方向。
** 通讯作者. Corresponding author. Tel：010-62733055; Fax：010-62732012; E-ail：[email protected]
344 中 国 病 毒 学 第21卷
已对这些重要的结构基因开展了大量的研究工作，然而尚缺乏对结构蛋白编码区可能的开放读码框(Open Reading Frame，ORF)中未知蛋白(Predicted Unknown Protein，PUP)[5,6]的深入研究。对这些未知蛋白的研究具有相当重要的意义，能够有助于了解疾病的传染过程、病毒的毒力变化以及控制该疾病的传播。例如，Orf7P2：5’-AAT-3’(26 mer, 27221－27246, SalⅠ)
Orf8P1：5’-AAAAAATTATTCTCTTC
-3’ (26 mer, 27254-27271, EcoRⅠ)
Orf8P2：5’-AA-3’(26 mer, 27605-27622, SalⅠ)
牛泡沫病毒(bovine foamy virus，BFV)，Orf-1蛋白是BFV的转录反式激活因子，可极大地激活病毒5′长末端重复序列（long termination repeat LTR）起始基因的表达[7]。顺式作用元件，DNA序列，分子内相互作用，是DNA与DNA作用；反式激活因子，蛋白质因子，是蛋白质对DNA的作用，是不同分子间作用。本文为了研究SARS-CoV中的未知蛋白，特别是Orf7，Orf8，Orf9蛋白在病毒基因表达调控中，是顺式作用元件或者反式作用因子。以分离并鉴定的BJ01毒株的cDNA为材料，采用PCR方法克隆SARS-CoV的orf7，orf8，orf9各基因片断，构建各种表达质粒，引入pDsRed作为报告基因，体外转染Hella细胞进行瞬时表达分析，荧光酶标仪读取细胞中荧光蛋白的表达量后，取适量细胞采用流式细胞仪进行分析，发现pcDNA3-Orf7与pEGFP共转染时pcDNA3-Orf7能够增强pEGFP的表达，pEGFP-Orf7与pDsRed共转染时pEGFP-Orf7可以增强pDsRed的表达。最终，结果首次证明了SARS-CoV编码的63个氨基酸的Orf7蛋白为SARS-CoV的反式激活因子。
1 材料与方法
1.1 实验材料
Hela细胞为本室保藏，SARS－CoV BJ01毒株的cDNA来自中国科学院武汉病毒研究所。细胞转染试剂Lipofectamine TM 2000购自Invitrogen （CA，USA），DMEM和胎牛血清均购自GIBCO/BRL公司。PCR试剂、常用的内切酶购自TaKaRa大连公司。DNA片断回收试剂盒购自北京鼎国生物技术有限责任公司。 1.2 引物
实验中使用的引物均参照已发表的序列[13]（GenBank AY278488）设计，由奥科生物公司合成，引物在正链基因组中的位置(均为5′→3′方向)，具体如下，（P1:表示上游引物；P2：表示下游引物；斜体字划线为引物中所引入的酶切位点；黑体字为原有的起始密码子ATG： Orf7P1：5’-AAATGTTTCATCTTGTTGAC
-3’(26 mer, 27055－27072 , EcoRⅠ)
Orf9P1：5’-AAAATGAGCTCACT-3’
(23mer, 27619-27633, EcoRⅠ)
Orf9P2：5’-AA(23mer, 27739－27753, SalⅠ)
1.3 PCR
按照TaKaRa PCR Kit 操作指南，各个基因的PCR条件经过多次预反应确定，在退火温度上稍有区别。循环数一般设为35个，结果经2%的琼脂糖凝胶电泳检测。其中以PCR orf7的条件为例：94℃ 4min后，进行下列循环：95℃ 30s，56℃ 35s，72℃ 30s，共35次循环，最后72℃再延伸10min，终止反应。 1.4 质粒构建
以赠送的SARS-CoV BJ01毒株的cDNA为模板，采用PCR方法扩增出orf7，orf8，orf9各个片断，然后用回收试剂盒回收PCR产物，最后用T4 DNA连接酶连接到pMD18-T（TakaRa, Dalian, China）载体上。酶切鉴定正确后，序列分析证明所得的片段为目的片段，再将各个片断分别亚克隆到pEGFP和pcDNA3(均为本室保藏)载体上。质粒的提取、连接、酶切、及转化的操作方法均参照文献[8]。 1.5 细胞培养与转染
用含10%胎牛血清的DMEM，37℃ 5% CO2条件下培养Hela细胞，用于转染。转染时，Hela细胞
以2.5×105mL－
1接种于24孔板，每孔500L。按照文献[8]方法，对各质粒进行纯化后，通过阳离子脂质体介导转染培养好的Hela细胞。pcDNA3-Orf7，pc DNA3-Orf8，pcDNA3-Orf9分别以相同的质量梯度与pEGFP共转染Hela细胞，pEGFP-orf7， pEGFP-orf8，pEGFP-orf9，pEGFP分别单独转染Hela细胞作为对照。同时，pEGFP-orf7与pDsRed共转染Hela细胞，以pEGFP，pDsRed，pEGFP-orf7，单独转染和pEGFP与pDsRed共转染作为对照。每种转染都设置三个重复，具体转染步骤参见LipofectamineTM 2000产品说明书（Invitrogen，CA，USA）。 1.6 荧光值测定
在细胞转染后的24h，48h，72h各时间点，分别在荧光显微镜下观察细胞的状态及各质粒的表达，进行拍照记录后，并使用荧光酶标仪测其细胞中荧光蛋白的表达量。
赵 琳, 等. SARS冠状病毒基因结构中未知蛋白Orf7的研究 345
1.7 流式检测表达红色和绿色荧光蛋白的细胞数量
引入pDsRed后，转染细胞后24h，48h，72h各时间点，在荧光显微镜下观察细胞状态后，取一定比例的细胞，0.25%的胰蛋白酶消化2min 后制成单细胞悬液，磷酸缓冲液（PBS）洗涤三次后，流式细胞仪检测表达红色和绿色荧光的细胞的数量。
2 结果
2.1 质粒构建及鉴定
以cDNA为模板，PCR扩增得到各目的片段orf7，orf8，orf9，大小分别为192bp，369bp，135bp，与预期大小相等。将各目的片断分别克隆到pMD18-T载体上，经序列分析结果正确后，用限制性内切酶EcoRⅠ和SalⅠ切下各目的片段，低熔点琼脂糖凝胶电泳回收各目的基因片断，再将回收得到的orf7，orf8，orf9基因片断亚克隆到pEGFP载体上，当EcoRⅠ和SalⅠ酶切鉴定正确，都会产生两条带，各片断大小分别为：pEGFP4700bp，orf7 192bp，orf8 369bp，orf9 135bp （如图1a所示）。同时，用限制性内切酶XbaⅠ和EcoRⅠ将orf7和orf8由pMD18－T载体上切下，按照同样的方法亚克隆到pcDNA3载体上，当XbaⅠ和EcoRⅠ酶切鉴定正确，也都会产生两条带，各片断大小分别为：pcDNA3 5400bp，orf7 192bp，orf8 369bp（如图1b所示）。
图1 重组质粒的酶切鉴定
Fig.1 Identification of recombinant plasmid by digestion
M1, DL 15000; 1, pEGFP-Orf7; 2, pEGFP-Orf8; 3, pEGFP-Orf9; 4, pcDNA3-Orf7; 5, pcDNA3-Orf8; M2, DL 2000.
2.2 转染及表达荧光细胞数量的检测
为了探讨SARS-CoV未知蛋白在转录调控过程中的作用，即顺式作用因子或反式作用因子。我们克隆了各基因片段orf7，orf8，orf9，成功构建出表达质粒pEGFP-Orf7，pEGFP-Orf8，pEGFP-Orf9，pcDNA3-Orf7，pcDNA3-Orf8。然后将pEGFP转染培养好的Hela细胞，作为对照，并将pEGFP-Orf7，pEGFP-Orf8，pEGFP-Orf9三种质粒分别单独转染Hela细胞，研究Orf7，Orf8，Orf9蛋白是否有顺式调控作用。同时，将pcDNA3-Orf7，pcDNA3-Orf8分别与pEGFP共转染Hela细胞，混合时都设有相同的梯度，研究Orf7，Orf8蛋白是否有反式调控作用。最终实验得出瞬时表达分析结果如图2和图3所示。
图2 细胞转染后绿色荧光蛋白的瞬时表达结果
Fig.2 Results of green fluorescence protein expressed in cell after transfection
Pictures at 72h after transfection.
346 中 国 病 毒 学 第21卷
从图2的结果可以看出，pcDNA3-Orf7与pEGFP共转染时，细胞中荧光较其它质粒单独转染或共转染的亮度更强，即说明pcDNA3-Orf7使pEGFP在细胞中的表达量增加。荧光酶标仪测其细胞中荧光蛋白的表达量得到荧光值（图3），这一结果进一步证实，随着pcDNA3-Orf7量的增加，荧光值成线性升高，且经t检验，pcDNA3-Orf7与pEGFP共转染相比pEGFP单独转染，细胞中的荧光值有显著差异性（P
图3 转染后细胞中绿色荧光值的测定
Fig.3 Detection of fluorescense value from cells after trans-
fection
A: pEGFP(5μg); B:pEGFP-ORF7(5μg); C:pEGFP-ORF8(5μg); D: pEGFP- ORF9(5μg); E1: pcDNA3-ORF7(2μg)+pEGFP(3μg); E2: pcDNA3- ORF7 (3μg)+pEGFP(3μg); E3: pcDNA3-ORF7(4μg)+pEGFP(3μg); F1: pcDNA3- ORF8(2μg)+ pEGFP(3μg); F2: pcDNA3-ORF8(3μg)+ pEGFP(3μg); F3: pcDNA3-ORF8(4μg )+ pEGFP(3μg)
3 讨论
冠状病毒的基因组结构一般较为紧凑，很少存在冗余的核苷酸，而不同的冠状病毒都确实存在部分非保守的ORF，这些ORF的功能都有待进一步的实验证实[9]。从进化树分析可以看出，SARS-CoV明显不同于其他三个冠状病毒群[10]。USCCDC[11]、
图4 表达绿色和红色荧光蛋白细胞数量的分析
Fig.4 Analysis the number cells expressing green or red fluor-
escence protein after transfection
Single-cell suspensions were prepared at 72h after transfection then washed and run on a flow cytometer.
加拿大BCCA基因组研究所[12]、北京华大基因组研究中心[13]均研究得出结论：在结构蛋白编码区可能的开放读码框(Open Reading Frame，ORF)中，存在已有蛋白质序列数据库中未找到任何同源序列的未知蛋白(Predicted Unknown Protein，PUP)。加拿大和美国的研究组，均对冠状病毒基因组的5’端非翻译区(UTR)和各个ORF起始密码子上游的区域进行了分析，以期待寻找到类似于其他冠状病毒“UCU AAAC”的，参与“不连续转录”识别的特征性转录调控序列。两个研究组均在orf1a、S 蛋白、ORF3、M 蛋白、ORF8、ORF9和N 蛋白上游，发现了一个保守的8 个核苷酸的“AAACGAAC”。另外，加拿大的研究还显示在其他几个ORF 上游，也有类似的转录调控序列。上述发现，进一步支持了冠状病毒的不连续转录模型，也为ORF 预测的准确性提供了强有力的证据。本文通过体外转染实验，只对Orf7、Orf8、Orf9进行了研究，首次证明了Orf7是SARS-CoV的反式转录激活因子。
尚需指出的是，SARS-CoV与其它冠状病毒同源性不高，核酸序列相似性分数是0.56～0.63，氨基酸序列的相似性分数是0.57～0.74[10]。这表明SARS-CoV与其它冠状病毒的基因表达调控机理有所不同，Orf7蛋白的反式转录激活作用机理也明显不同，暗示SARS-CoV的复制、基因表达调控有其独到之处，还需要进一步研究。加拿大研究组应用已有的工具对ORFs这类蛋白质的结构及功能进行了分析，作出了初步的推断，但是还需要实验的验证。清楚的了解这些非结构蛋白的功能，也许有助于SARS的预防及治疗。
GFP是一种生物发光物质，其荧光的强弱取决于蛋白的含量；GFP分子量小，无细胞毒性，因此可在活细胞体内长期存在。由于稳定表达的细胞株
赵 琳, 等. SARS冠状病毒基因结构中未知蛋白Orf7的研究 347
生长状态正常，荧光没有衰变，可在胞内动态观察所研究蛋白质，并推测其转运过程和代谢通路以及对细胞的影响。因此GFP是一种理想的生物分子标签[14]。本研究构建融合基因，利用GFP表达量的变化观察ORF在基因表达调控中的作用，便于观察且取得良好效果。pDsRed是Clonetech公司的第1代红色荧光蛋白，在细胞中通常以四聚体的形式存在，可溶性不及EGFP，毒性也较大。但是在本实验中没有观察到pDsRed对细胞的活力有明显的影响，只是等量的pDsRed和pEGFP转染细胞时，pDsRed较pEGFP得到较少的阳性的细胞，荧光强度也较弱，并不影响本实验结果的比较。
目前研究表明，SARS 病毒很可能是原先寄生在野生动物体内，由于与人发生频繁接触后，传染到人身上[15]。虽然SARS 近期已从人们视线中消失，但是这并不能说明它不会卷土重来，再次引发新一轮的疾病流行。由于冠状病毒的结构和序列变异的非常快，因此使得找到广谱的疫苗非常困难。靶向一种病毒株的疫苗可能无法有效抵抗另外一种病毒株。人们对病原体进行深入了解是预防和治疗SARS的必要手段，仅仅靠已知的SARS 病毒蛋白是不足以构成这样凶猛的病毒的，本文主要着眼于未知的开放阅读框编码的蛋白在转录调控中作用的研究具有重要意义，其机理及其它的开放阅读框的研究都是都是非常重要且有待进行的。彻底弄清楚SARS 病毒的蛋白组成，不仅具有极高的科学研究价值，也将为医学上早日找到预防治疗SARS的药物奠定理论基础。
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第21卷4期 中 国 病 毒 学 21（4）：343-347
收稿日期：2006-01-20，修回日期：2006-02-27
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作者简介：赵 琳（1979-），女， 内蒙古籍，硕士，分子免疫学研究方向。
** 通讯作者. Corresponding author. Tel：010-62733055; Fax：010-62732012; E-ail：[email protected]
344 中 国 病 毒 学 第21卷
已对这些重要的结构基因开展了大量的研究工作，然而尚缺乏对结构蛋白编码区可能的开放读码框(Open Reading Frame，ORF)中未知蛋白(Predicted Unknown Protein，PUP)[5,6]的深入研究。对这些未知蛋白的研究具有相当重要的意义，能够有助于了解疾病的传染过程、病毒的毒力变化以及控制该疾病的传播。例如，Orf7P2：5’-AAT-3’(26 mer, 27221－27246, SalⅠ)
Orf8P1：5’-AAAAAATTATTCTCTTC
-3’ (26 mer, 27254-27271, EcoRⅠ)
Orf8P2：5’-AA-3’(26 mer, 27605-27622, SalⅠ)
牛泡沫病毒(bovine foamy virus，BFV)，Orf-1蛋白是BFV的转录反式激活因子，可极大地激活病毒5′长末端重复序列（long termination repeat LTR）起始基因的表达[7]。顺式作用元件，DNA序列，分子内相互作用，是DNA与DNA作用；反式激活因子，蛋白质因子，是蛋白质对DNA的作用，是不同分子间作用。本文为了研究SARS-CoV中的未知蛋白，特别是Orf7，Orf8，Orf9蛋白在病毒基因表达调控中，是顺式作用元件或者反式作用因子。以分离并鉴定的BJ01毒株的cDNA为材料，采用PCR方法克隆SARS-CoV的orf7，orf8，orf9各基因片断，构建各种表达质粒，引入pDsRed作为报告基因，体外转染Hella细胞进行瞬时表达分析，荧光酶标仪读取细胞中荧光蛋白的表达量后，取适量细胞采用流式细胞仪进行分析，发现pcDNA3-Orf7与pEGFP共转染时pcDNA3-Orf7能够增强pEGFP的表达，pEGFP-Orf7与pDsRed共转染时pEGFP-Orf7可以增强pDsRed的表达。最终，结果首次证明了SARS-CoV编码的63个氨基酸的Orf7蛋白为SARS-CoV的反式激活因子。
1 材料与方法
1.1 实验材料
Hela细胞为本室保藏，SARS－CoV BJ01毒株的cDNA来自中国科学院武汉病毒研究所。细胞转染试剂Lipofectamine TM 2000购自Invitrogen （CA，USA），DMEM和胎牛血清均购自GIBCO/BRL公司。PCR试剂、常用的内切酶购自TaKaRa大连公司。DNA片断回收试剂盒购自北京鼎国生物技术有限责任公司。 1.2 引物
实验中使用的引物均参照已发表的序列[13]（GenBank AY278488）设计，由奥科生物公司合成，引物在正链基因组中的位置(均为5′→3′方向)，具体如下，（P1:表示上游引物；P2：表示下游引物；斜体字划线为引物中所引入的酶切位点；黑体字为原有的起始密码子ATG： Orf7P1：5’-AAATGTTTCATCTTGTTGAC
-3’(26 mer, 27055－27072 , EcoRⅠ)
Orf9P1：5’-AAAATGAGCTCACT-3’
(23mer, 27619-27633, EcoRⅠ)
Orf9P2：5’-AA(23mer, 27739－27753, SalⅠ)
1.3 PCR
按照TaKaRa PCR Kit 操作指南，各个基因的PCR条件经过多次预反应确定，在退火温度上稍有区别。循环数一般设为35个，结果经2%的琼脂糖凝胶电泳检测。其中以PCR orf7的条件为例：94℃ 4min后，进行下列循环：95℃ 30s，56℃ 35s，72℃ 30s，共35次循环，最后72℃再延伸10min，终止反应。 1.4 质粒构建
以赠送的SARS-CoV BJ01毒株的cDNA为模板，采用PCR方法扩增出orf7，orf8，orf9各个片断，然后用回收试剂盒回收PCR产物，最后用T4 DNA连接酶连接到pMD18-T（TakaRa, Dalian, China）载体上。酶切鉴定正确后，序列分析证明所得的片段为目的片段，再将各个片断分别亚克隆到pEGFP和pcDNA3(均为本室保藏)载体上。质粒的提取、连接、酶切、及转化的操作方法均参照文献[8]。 1.5 细胞培养与转染
用含10%胎牛血清的DMEM，37℃ 5% CO2条件下培养Hela细胞，用于转染。转染时，Hela细胞
以2.5×105mL－
1接种于24孔板，每孔500L。按照文献[8]方法，对各质粒进行纯化后，通过阳离子脂质体介导转染培养好的Hela细胞。pcDNA3-Orf7，pc DNA3-Orf8，pcDNA3-Orf9分别以相同的质量梯度与pEGFP共转染Hela细胞，pEGFP-orf7， pEGFP-orf8，pEGFP-orf9，pEGFP分别单独转染Hela细胞作为对照。同时，pEGFP-orf7与pDsRed共转染Hela细胞，以pEGFP，pDsRed，pEGFP-orf7，单独转染和pEGFP与pDsRed共转染作为对照。每种转染都设置三个重复，具体转染步骤参见LipofectamineTM 2000产品说明书（Invitrogen，CA，USA）。 1.6 荧光值测定
在细胞转染后的24h，48h，72h各时间点，分别在荧光显微镜下观察细胞的状态及各质粒的表达，进行拍照记录后，并使用荧光酶标仪测其细胞中荧光蛋白的表达量。
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1.7 流式检测表达红色和绿色荧光蛋白的细胞数量
引入pDsRed后，转染细胞后24h，48h，72h各时间点，在荧光显微镜下观察细胞状态后，取一定比例的细胞，0.25%的胰蛋白酶消化2min 后制成单细胞悬液，磷酸缓冲液（PBS）洗涤三次后，流式细胞仪检测表达红色和绿色荧光的细胞的数量。
2 结果
2.1 质粒构建及鉴定
以cDNA为模板，PCR扩增得到各目的片段orf7，orf8，orf9，大小分别为192bp，369bp，135bp，与预期大小相等。将各目的片断分别克隆到pMD18-T载体上，经序列分析结果正确后，用限制性内切酶EcoRⅠ和SalⅠ切下各目的片段，低熔点琼脂糖凝胶电泳回收各目的基因片断，再将回收得到的orf7，orf8，orf9基因片断亚克隆到pEGFP载体上，当EcoRⅠ和SalⅠ酶切鉴定正确，都会产生两条带，各片断大小分别为：pEGFP4700bp，orf7 192bp，orf8 369bp，orf9 135bp （如图1a所示）。同时，用限制性内切酶XbaⅠ和EcoRⅠ将orf7和orf8由pMD18－T载体上切下，按照同样的方法亚克隆到pcDNA3载体上，当XbaⅠ和EcoRⅠ酶切鉴定正确，也都会产生两条带，各片断大小分别为：pcDNA3 5400bp，orf7 192bp，orf8 369bp（如图1b所示）。
图1 重组质粒的酶切鉴定
Fig.1 Identification of recombinant plasmid by digestion
M1, DL 15000; 1, pEGFP-Orf7; 2, pEGFP-Orf8; 3, pEGFP-Orf9; 4, pcDNA3-Orf7; 5, pcDNA3-Orf8; M2, DL 2000.
2.2 转染及表达荧光细胞数量的检测
为了探讨SARS-CoV未知蛋白在转录调控过程中的作用，即顺式作用因子或反式作用因子。我们克隆了各基因片段orf7，orf8，orf9，成功构建出表达质粒pEGFP-Orf7，pEGFP-Orf8，pEGFP-Orf9，pcDNA3-Orf7，pcDNA3-Orf8。然后将pEGFP转染培养好的Hela细胞，作为对照，并将pEGFP-Orf7，pEGFP-Orf8，pEGFP-Orf9三种质粒分别单独转染Hela细胞，研究Orf7，Orf8，Orf9蛋白是否有顺式调控作用。同时，将pcDNA3-Orf7，pcDNA3-Orf8分别与pEGFP共转染Hela细胞，混合时都设有相同的梯度，研究Orf7，Orf8蛋白是否有反式调控作用。最终实验得出瞬时表达分析结果如图2和图3所示。
图2 细胞转染后绿色荧光蛋白的瞬时表达结果
Fig.2 Results of green fluorescence protein expressed in cell after transfection
Pictures at 72h after transfection.
346 中 国 病 毒 学 第21卷
从图2的结果可以看出，pcDNA3-Orf7与pEGFP共转染时，细胞中荧光较其它质粒单独转染或共转染的亮度更强，即说明pcDNA3-Orf7使pEGFP在细胞中的表达量增加。荧光酶标仪测其细胞中荧光蛋白的表达量得到荧光值（图3），这一结果进一步证实，随着pcDNA3-Orf7量的增加，荧光值成线性升高，且经t检验，pcDNA3-Orf7与pEGFP共转染相比pEGFP单独转染，细胞中的荧光值有显著差异性（P
图3 转染后细胞中绿色荧光值的测定
Fig.3 Detection of fluorescense value from cells after trans-
fection
A: pEGFP(5μg); B:pEGFP-ORF7(5μg); C:pEGFP-ORF8(5μg); D: pEGFP- ORF9(5μg); E1: pcDNA3-ORF7(2μg)+pEGFP(3μg); E2: pcDNA3- ORF7 (3μg)+pEGFP(3μg); E3: pcDNA3-ORF7(4μg)+pEGFP(3μg); F1: pcDNA3- ORF8(2μg)+ pEGFP(3μg); F2: pcDNA3-ORF8(3μg)+ pEGFP(3μg); F3: pcDNA3-ORF8(4μg )+ pEGFP(3μg)
3 讨论
冠状病毒的基因组结构一般较为紧凑，很少存在冗余的核苷酸，而不同的冠状病毒都确实存在部分非保守的ORF，这些ORF的功能都有待进一步的实验证实[9]。从进化树分析可以看出，SARS-CoV明显不同于其他三个冠状病毒群[10]。USCCDC[11]、
图4 表达绿色和红色荧光蛋白细胞数量的分析
Fig.4 Analysis the number cells expressing green or red fluor-
escence protein after transfection
Single-cell suspensions were prepared at 72h after transfection then washed and run on a flow cytometer.
加拿大BCCA基因组研究所[12]、北京华大基因组研究中心[13]均研究得出结论：在结构蛋白编码区可能的开放读码框(Open Reading Frame，ORF)中，存在已有蛋白质序列数据库中未找到任何同源序列的未知蛋白(Predicted Unknown Protein，PUP)。加拿大和美国的研究组，均对冠状病毒基因组的5’端非翻译区(UTR)和各个ORF起始密码子上游的区域进行了分析，以期待寻找到类似于其他冠状病毒“UCU AAAC”的，参与“不连续转录”识别的特征性转录调控序列。两个研究组均在orf1a、S 蛋白、ORF3、M 蛋白、ORF8、ORF9和N 蛋白上游，发现了一个保守的8 个核苷酸的“AAACGAAC”。另外，加拿大的研究还显示在其他几个ORF 上游，也有类似的转录调控序列。上述发现，进一步支持了冠状病毒的不连续转录模型，也为ORF 预测的准确性提供了强有力的证据。本文通过体外转染实验，只对Orf7、Orf8、Orf9进行了研究，首次证明了Orf7是SARS-CoV的反式转录激活因子。
尚需指出的是，SARS-CoV与其它冠状病毒同源性不高，核酸序列相似性分数是0.56～0.63，氨基酸序列的相似性分数是0.57～0.74[10]。这表明SARS-CoV与其它冠状病毒的基因表达调控机理有所不同，Orf7蛋白的反式转录激活作用机理也明显不同，暗示SARS-CoV的复制、基因表达调控有其独到之处，还需要进一步研究。加拿大研究组应用已有的工具对ORFs这类蛋白质的结构及功能进行了分析，作出了初步的推断，但是还需要实验的验证。清楚的了解这些非结构蛋白的功能，也许有助于SARS的预防及治疗。
GFP是一种生物发光物质，其荧光的强弱取决于蛋白的含量；GFP分子量小，无细胞毒性，因此可在活细胞体内长期存在。由于稳定表达的细胞株
赵 琳, 等. SARS冠状病毒基因结构中未知蛋白Orf7的研究 347
生长状态正常，荧光没有衰变，可在胞内动态观察所研究蛋白质，并推测其转运过程和代谢通路以及对细胞的影响。因此GFP是一种理想的生物分子标签[14]。本研究构建融合基因，利用GFP表达量的变化观察ORF在基因表达调控中的作用，便于观察且取得良好效果。pDsRed是Clonetech公司的第1代红色荧光蛋白，在细胞中通常以四聚体的形式存在，可溶性不及EGFP，毒性也较大。但是在本实验中没有观察到pDsRed对细胞的活力有明显的影响，只是等量的pDsRed和pEGFP转染细胞时，pDsRed较pEGFP得到较少的阳性的细胞，荧光强度也较弱，并不影响本实验结果的比较。
目前研究表明，SARS 病毒很可能是原先寄生在野生动物体内，由于与人发生频繁接触后，传染到人身上[15]。虽然SARS 近期已从人们视线中消失，但是这并不能说明它不会卷土重来，再次引发新一轮的疾病流行。由于冠状病毒的结构和序列变异的非常快，因此使得找到广谱的疫苗非常困难。靶向一种病毒株的疫苗可能无法有效抵抗另外一种病毒株。人们对病原体进行深入了解是预防和治疗SARS的必要手段，仅仅靠已知的SARS 病毒蛋白是不足以构成这样凶猛的病毒的，本文主要着眼于未知的开放阅读框编码的蛋白在转录调控中作用的研究具有重要意义，其机理及其它的开放阅读框的研究都是都是非常重要且有待进行的。彻底弄清楚SARS 病毒的蛋白组成，不仅具有极高的科学研究价值，也将为医学上早日找到预防治疗SARS的药物奠定理论基础。
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