大肠杆菌基因组减小研究进展_方宏清

564

doi:10．3969／j．issn．1009－0002．2009．04．033

LETTERS IN BIOTECHNOLOGY

生物技术通讯

Vol．20No．4July, 2009

综述

大肠杆菌基因组减小研究进展

方宏清，陈惠鹏

军事医学科学院生物工程研究所，北京100071［摘要］

大肠杆菌是遗传重组领域广泛应用的宿主之一，用于生产重组蛋白、氨基酸和其他化学品。基因组减小可以减少

代谢调节网络中的冗余，提高其预测性和可控性。我们介绍了最小基因组的研究策略、应用无痕敲除技术减小大肠杆菌基因组的方法，以及基因组减小后对菌体生长特性、附加体稳定性、重组蛋白表达和代谢的影响。［关键词］

大肠杆菌；无痕敲除；基因组减小；最小基因组

［中图分类号］

Q756［文献标识码］A ［文章编号］1009－0002(2009)04－0564－04

Progress in Development of Reduced－GenomeEscherichia coli

FANG Hong－Qing,CHEN Hui－Peng

Beijing Institute of Biotechnology, Beijing 100071, China

［Abstract ］

Escherichia coli is one of the best hosts for genetic recombination and has been used in the pharmaceutical

amino aicds and other chemicals．

Genome size reduction may

and provide a more predictable and controllable system

and fermentation industries to make recombinant proteins,

decrease the redundancy of regulatory and metabolic networks, genome by markerless deletion,

［Key words ］

than the wild type strain．In this paper we reviewed the research tactics for a minimum genome, the methods of reducing

the growth characteristics of the reduced－genomestrain and its effect on the plasmid sta-bility, the recombinant protein expression and the metabolism．

Escherichia coli ; markerless deletion; reduced genome; minimum genome

大肠杆菌中很普遍，包括大量自发的无效突变和倒位。许多事例表明，在实验操作中转座子跳跃时常不引人注意地发生。另一个

大肠杆菌是了解得最清楚、分析得最透彻的微生物，是遗传学研究、生化研究和代谢模拟研究的平台。大肠杆菌是遗传重组领域广泛应用的宿主之一，在医药和发酵工业中用于生产重组蛋白、氨基酸和其他化学品。因为大肠杆菌在动物肠道和环境中进化，其部分基因组对某些用途是不需要的，甚至可能是有害的。因此，通过删除尽可能多的基因片段，构建遗传稳定的“空白”菌株，可使大肠杆菌具有健壮的代谢行为，同时也可以添加具有实际用途的基因。

第一个大肠杆菌的基因组序列（K12菌株MG1655）于1997年测序完毕[1]，促进了大肠杆菌的代谢工程研究。然而，其基因中大约40％的功能是未知的，其细胞内复杂的代谢调节网络也时常干扰途径设计和改造。基因组减少可以改善代谢效率，降低大肠杆菌基因和调节环路中的冗余部分。

大肠杆菌还存在可转位元件，导致遗传不稳定性。介导重组事件（如转座、水平基因转移）的可移动DNA 元件，包括插入序列元件（IS ）、转座酶、缺陷噬菌体、整合酶及位点特异性重组酶，散布在整个基因组中。即使没有转座酶，DNA 重复序列通过同源重组也会产生倒位、复制和删除。例如，MG1655含有10类44个可转位元件、6个拷贝的Rhs （一种类似转座子的重复序列，但没有数据指明其可以移动），基因组还含有8个原噬菌体或噬菌体残余。与可转位元件相关的转座酶可在应激状态下（如热激、冷激、电转等）被诱导。与转座子活性相关的基因组重排和突变在

［收稿日期］2008－12－04

［作者简介］方宏清（1966－），男，副研究员，博士研究生，

（E－mail）fanghongqing＠yahoo．com．cn

1大肠杆菌基因组减小的目的和意义

已测序的实验室菌株W3110与MG1655几乎完全相同，在蛋白编码区仅有8个位点存在差异[2]。更令人惊奇地是，在人类基因组序列草图中发现了大约18例转位元件（多为IS186、IS2、IS5），而在GenBank 数据库中更多。为了稳定基因组和代谢流，这些元件必须删除，不需要的功能（如与人体或特殊环境相关）必须去掉。很明显，一个稳定的菌株是生产及科学实验所需的。

一个可预测、可控制的细胞系统或称“细胞工厂”能够在代谢工程领域发挥更好的作用。在欧盟第五次框架计划（1998～

2002）中，曾实施了“细胞工厂”研究计划，以全面了解应用中的

微生物。该计划的主要成就之一是完成了枯草杆菌的分泌组研究。美国能源部在2002年开展了从基因组到生命（Genomes to

Life ，GTL ）的研究计划，目标是创建人工生命。GTL 计划的主要研

究内容之一是合成基因组。文特尔研究所（J．CraigVenter Insti-

tute ）在构建最小的基因组，用于能源和其他应用领域。在日本，

经工贸部和新能源及工业技术部在2001年启动了“最小基因组工厂”计划（Minimum Genome Factory ，MGF ），针对几种模式微生物开展基因组工程和功能基因组研究，构建具有较小基因组（只有必需基因）的微生物用于工业生产。此类最小基因组微生物是代谢工程和计算机模拟的理想平台。在此应说明，最小基因组并

方宏清等：大肠杆菌基因组减小研究进展

不是指一套最小、最基本的基因，而是指一套被选择的、适当的有工业用途的基因。

565

在另一项大肠杆菌最小基因组研究中[12－13]，原始设计删除区域是基于不影响大肠杆菌生长或基本代谢。通过比较大肠杆菌和Buchnera sp．（一种圆形原核生物，在蚜虫的细胞内共生）的基因组，选择大肠杆菌染色体上可有可无的区域。Buchnera sp．与大肠杆菌具有共同的祖先，在进化过程中这个共生体只保留了

2

2．1

最小基因组的研究策略

从头合成法

获得最小基因组细胞的最有效途径应该是合成生物学技

0．64Mb 的小基因组[14]。将在Buchnera sp．中不存在的区域作为

候选删除靶区。但Buchnera sp．缺少在M9培养基中生长所需的氨基酸、脂多糖和磷脂等合成基因。在保留了一些必需基因后，最后将大于含有10个连续非必需基因区作为候选删除区域，共选择了83个这样的区域。

此外，又将转座基因、插入序列和毒

素－抗毒素对也选择为待删除区域，这样又增加了20个。最终确定了103个候选删除区域，总长1830kb 。候选区域分别单独删除，然后通过P1转导累积到单个染色体中。每一个中间删除菌都要进行生长速率检测。如果某个新删除的基因影响生长，则从最小基因组设计中剔除。最终删除了1．03Mb ，基因组减小了

术。精确合成大DNA 分子的方法已建立。人工合成基因组的第一个例子是2002年报道的7440bp 的脊髓灰质炎病毒DNA [3]，耗时3年。2003报道的一种新方法，仅2周就合成了5386bp 的噬菌体基因组[4]。2008年报道成功合成582970bp 的支原体基因组[5]。随着DNA 合成技术的发展，合成更大的基因组成为可能。随之而来的问题将是如何使其成为一个可复制的基因组，成为一个真正的生命。

2．2应用基因组减小方法

基因组减小方法已在大肠杆菌、枯草杆菌、酵母等基因组上

22％。该菌株被命名为MGF－01。

得到实施。基因组减小可以减少代谢调节网络中的冗余，提高其预测性和可控性。此外，大肠杆菌基因组工程可以对基因组进行大规模修饰。如Posfai 等删除了大肠杆菌基因组内782个基因，包括所有可移动元件，以稳定其基因型[6]；Hashimoto 等将大肠杆菌基因组减小29．7％，只保留了3169个基因[7]。比较基因组杂交数据显示大肠杆菌染色体上的基因数目可以减至3000个[8]。根据目前的进展，通过基因组减小途径获得一个最小基因组工厂，要比合成基因组途径更快、更易实施。

3

3．1

基因组减小研究的常用方法

Red 重组技术与Sce Ⅰ切割筛选相结合[6,10]

见图1。敲除A 和B 之间的区域，首先PCR 构建一个线性

DNA 分子，包含两侧40～60bp 的同源区（A 、B 和C ），中间有一

个抗性基因（两边各有1个I－Sce Ⅰ酶切位点）；然后电转到靶细胞中，在Red 重组酶的作用下，通过同源区A 和C 发生双交叉置换，替代染色体片段。通过抗性筛选，经PCR 证实插入位点。注意置换后染色体上有2个B 区，同时抗性基因两侧各有1个I－Sce

2．3基因组删除区域的选择

一种是比较不同的大肠杆菌基因组序列。比较大肠杆菌

K12和O157∶H7的基因组[9]，发现一个惊人模式，成百上千的菌

株特异的“岛屿”插入共同的“骨架”中，完全相同的“骨架”中散布着完全不同的“岛屿”。根据菌株来源的不同，这些特异的岛屿被称为K 岛屿、O 岛屿和C 岛屿。MG1655的骨架基因组大小约

Ⅰ位点。最后诱导I－Sce Ⅰ酶表达，染色体在整合位置发生断裂，

然后通过RecA 介导的分子内重组修复断裂的双链。由于在断裂末端有一个短的同源B 区，重组修饰易于通过这些同源区发生。生存的菌落用PCR 筛选正确克隆。

这个方法的特点：靶向线性DNA 片段长度约1．7kb ，同源区A 、B 和C 的大小分别位40～80、40～60和40～45bp 。约200～

3．7Mb ，K 岛总和约为0．9Mb 。因此，删除所有K 岛将使基因组

减小20％。

假设某个区域只在其中一个菌株中存在，那么其功能在普通培养条件下是非必需的。Kolisnychenko 等[10]通过比较MG1655（K12）[1]和EDL933（O157:H7）的基因组[11]，选择了12个删除区域，包含11个大的K 岛和6个小岛。一般情况下，删除终点位于非编码区，与被删除的最近的开放读框（ORF ）相邻。由于引物设计的考虑，在少数情况下删除终点移到编码区，留下删除ORF 的

3＇端区域。删除后并未产生新的融合蛋白；8个删除区域中含有

隐蔽原噬菌体或噬菌体残余；删除区域含有高于平均水平的未知ORF 。所有删除操作都获得了成功，但不同区域插入效率差异很大，而且都低于其他文献报道。他们最后获得了MDS12菌株，基因组减小了8．1％。

在上述工作基础上，Posfai 等[6]通过一系列基因组序列比较识别存在于K12，但在其他5株大肠杆菌中不存在的序列，产生约100个删除（基因组的20％），编码900个基因。开始，删除大的岛、含有IS 的岛及含有IS 元件的个别基因。采用基于Red 重组系统的无痕删除技术。每一步删除都通过在基本培养基中的生长能力进行检验，然后通过P1转导将删除累积到单个菌株。通过测序及DNA 微阵列杂交验证删除端点。他们构建了不含可移动元件的基因组减小菌株MDS40－43，基因组减小了15％。

图1

Red－I－Sce Ⅰ

法无痕删除基因

566

500ng 的DNA 片段电转到MG1655中，可获得10～200个抗性

菌落，其中5％～90％在正确位点插入。相对较低的正确插入菌落数是该方法的限制因素。有报道，打靶DNA 片段内部存在与染色体序列同源的区域是引起低整合效率的原因。模板质粒

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生物技术通讯

Vol．20No．4July, 2009

转座体（transposome ），按标准程序电转入MG1655中。应用抗性筛选标记选择转座子插入突变体，并将突变株基因组用Cla Ⅰ消化后用Southern 印迹确证只有一个转座子插入，插入位点及插入方向通过以Tn5内部引物直接进行基因组测序来鉴定。应用这种方法构建了2个各400个突变子库（分别为Km r 和Cm r ），然后通过P1转导获得双抗、含2个loxP 位点的菌株。表达Cre 重组酶诱导loxP 位点之间重组，2个位点之间序列被切除。可以继续通过P1转导将突变累积到单个菌株中，应用无痕敲除技术去掉抗性标记和loxP 位点。

pSG76－CS带有一个78bp 的IS1序列，被拷贝到打靶DNA 片

段。因为IS1在MG1655基因组中有7个拷贝，看起来会干扰整合过程。但是，将这个78bp 的同源区从质粒删除后得到质粒

pSG76－CSH，以其为模板构建打靶片段，并未观察到整合子数量

增加。删除区域大小为7～82kb ，与整合效率没有明显的相关性。

在第二个步骤，双链断裂修复效率较高。在I－Sce Ⅰ诱导表达后，10％～100％的存活细胞带有目标删除。染色体断裂末端应靠近B 区，否则重组修复会通过其他随机存在的短同源片段进行。在靶片段中含有2个I－Sce Ⅰ位点，会提高通过B 区的重组修复效率。RecA 在双链断裂重组修复过程中起主要作用，如

recA 基因缺失菌株就会丧失重组修复能力。3．2

应用两步Red 重组技术正负筛选[7]

该方法是采用2次Red 重组方法无痕删除靶基因。第1次重组以氯霉素抗性基因cat 为正筛选标记，替换染色体上靶区域；第2次重组以链霉素敏感的rpsL 和蔗糖敏感的sacB 基因为负筛选标记，消除筛选标记基因，从而获得无痕删除。采用2种负筛选标记的目的主要是提高阳性率。

图3应用Tn5靶向的Cre ／loxP 切除系统删除基因（OE 为转座酶外末端识别序列，b 表示基因位点标识

）

4基因组减小应用研究进展

Kolisnychenko 等

[10]

将MG1655基因组减小了8．1％，得到

MDS12菌株，没有改变其生长特性。但Hashimoto 等[7]将MG1655

基因组减少29．7％得到Δ16菌株，发现对生长及染色体分离有严重损害，Δ16菌株的类核组织表现异常，形态异常，且生长速率较低，代时为45．4min ，而原始菌代时为26．2min ，在M9基本培养基中不能生长。Posfai 等则完全删除了MG1655中的可移动元件，得到了MDS40、41、42和43[6]。

图2

两步Red 重组法无痕删除基因

这些基因组减小的菌株的生长速率与MG1655类似，复制弧长度的变化对此没有影响。MDS42的电转效率比MG1655高2个数量级，与DH10B 相当。

一些重组蛋白难以在大肠杆菌中表达，如霍乱毒素B 亚单位与兔出血热病毒VP60的融合蛋白（CTXVP60）。单独表达这2个基因的质粒在常用大肠杆菌宿主中都很稳定，但表达该融合蛋白的质粒pCTBXVP60在常用宿主中则不稳定，其原因是由于融合蛋白的表达提高了IS 转座频率。但在MDS 菌株中该融合蛋白能有效表达。MDS 菌株也适于其他重组蛋白的表达[6,16－17]。

在工业生产上，IS 转座使重要生产菌株的基因突变，从而需要重新构建生产菌株。在应激诱导下，IS 转座现象时有发生。如紫外线会诱导IS10转座，热激或蛋白过表达会诱导转座酶转录，营养缺乏也会诱导某些IS 元件转座。由于这类原因，商业购买的

3．3Tn5靶向的Cre ／loxP 切除系统

[15]

该方法是将Tn5转座突变技术、Cre ／loxP 切离系统和噬菌体

P1转导结合起来，创造了一种组合删除技术。带有loxP 重组位

点的改构Tn5转座子随机插入染色体的基因内。2个loxP 位点通过P1噬菌体转导作用带入同一个菌株中，然后由Cre 重组酶删除2个位点之间的序列。

首先构建转座子，以质粒pTnKloxP 和pTnCloxP 为模板，

PCR 扩增获得线性转座子TnKloxP 和TnCloxP ，分别含有抗性基

因（Km 和Cm ）、loxP 位点、两侧有超活性19bp 的外末端转座

r

r

酶识别序列（outer－endtransposase recognition sequence ，OE ）。

500ng 的转座子与10U Tn5转座酶在室温孵育30min ，形成

方宏清等：大肠杆菌基因组减小研究进展

质粒偶尔也会被污染，含有IS 序列（如IS1）的质粒在DH10B 宿主中培养时，质粒序列中常存在IS1、IS2、IS5和IS10插入。而在

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MDS40宿主中则没有此类现象发生[6]。

慢病毒载体含有较长的正向重复序列，在大肠杆菌中极不稳定，长末端重复序列（LTR ）之间的区域易丢失，难以获得真实克隆。Invitrogen 公司提供的菌株STBL3能够部分解决问题，但存在一些缺点，如生长慢、对噬菌体T1敏感、难以制备感受态。基因组减小菌株MDS40、41或42不含插入序列，能够降低质粒重组事件。MDS42的生长速率（代时为30min ）比STBL3快（代时为40min ）。用MDS42作为宿主可以提高慢病毒载体的稳定性，并提高载体的产量[18]。

应用无IS 序列的宿主菌MDS42可以提高质粒的稳定性，降低突变发生率，也可以表达一些毒性蛋白。这对蛋白药物、DNA 疫苗及基因治疗药物的生产意义重大。

Mizoguchi 等通过无痕敲除方法删除103个候选区域，有84

个删除突变株的生长行为与野生株类似。将这些删除累积起来构建了一个基因组减小菌株，通过28个循环将53个删除累积起来构建了MGF－01，并通过比较基因组杂交进行确证。他们共删除了1080个基因，包括125个未知功能基因，基因组长度减小了1．03Mb ，GC 含量增加了0．27％达到51．8％。MGF－01在M9基本培养基中的生长行为与出发菌W3110基本类似，但在培养后期的生长速度高于W3110，培养30h 后MGF－01的菌密度是

W3110的1．5倍。乙酸分析表明，MGF－01菌产生的乙酸不及野

生菌的一半，这可能是由于MGF－01具有较高的乙醛酸穿梭活性。DNA 微阵列分析表明，与W3110相比，MGF－01的异柠檬酸裂解酶和苹果酸合成酶基因的表达水平分别提高了6．9倍和4．7倍。此外，将合成苏氨酸的遗传单元（ΔmetA::thrABC－cat）整合到野生型和MGF－01的染色体上，在培养48h 后苏氨酸的产量分别为4．4和10．6g ／L 。以MGF－01为初始材料可以构建更好的

MGF 细胞，进一步改善其生长、代谢行为

[12－13]

。

5结语

由于遗传学背景较清楚、生长速度快、培养基条件要求较

低等特点，长期以来，大肠杆菌都是商业生产上最常用的表达系统。改造大肠杆菌用于制备传统的化学品或中间体是当前的研究热点之一。在自然界中存在着丰富的药用化合物资源，常常蕴藏着化学合成难以实现的结构，如氨基莽草酸、青蒿素等。直接从天然植物中提取受限于原料来源、产地等诸多因素的限制，而通过改造大肠杆菌可以生产氨基莽草酸[19]和青蒿素[20]。

大肠杆菌基因组改造技术已日趋成熟。通过基因组减小研究，不仅能够帮助理解基因的功能，而且还可以构建一个“干净”的宿主，以维持外源基因稳定性，适于大规模培养。这样的宿主在重组蛋白表达、基因治疗或疫苗载体的制备，以及药用化合物和大宗化学品的制备等方面具有重要应用前景。

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大肠杆菌是遗传重组领域广泛应用的宿主之一，用于生产重组蛋白、氨基酸和其他化学品。基因组减小可以减少

代谢调节网络中的冗余，提高其预测性和可控性。我们介绍了最小基因组的研究策略、应用无痕敲除技术减小大肠杆菌基因组的方法，以及基因组减小后对菌体生长特性、附加体稳定性、重组蛋白表达和代谢的影响。［关键词］

大肠杆菌；无痕敲除；基因组减小；最小基因组

［中图分类号］

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［Key words ］

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大肠杆菌中很普遍，包括大量自发的无效突变和倒位。许多事例表明，在实验操作中转座子跳跃时常不引人注意地发生。另一个

大肠杆菌是了解得最清楚、分析得最透彻的微生物，是遗传学研究、生化研究和代谢模拟研究的平台。大肠杆菌是遗传重组领域广泛应用的宿主之一，在医药和发酵工业中用于生产重组蛋白、氨基酸和其他化学品。因为大肠杆菌在动物肠道和环境中进化，其部分基因组对某些用途是不需要的，甚至可能是有害的。因此，通过删除尽可能多的基因片段，构建遗传稳定的“空白”菌株，可使大肠杆菌具有健壮的代谢行为，同时也可以添加具有实际用途的基因。

第一个大肠杆菌的基因组序列（K12菌株MG1655）于1997年测序完毕[1]，促进了大肠杆菌的代谢工程研究。然而，其基因中大约40％的功能是未知的，其细胞内复杂的代谢调节网络也时常干扰途径设计和改造。基因组减少可以改善代谢效率，降低大肠杆菌基因和调节环路中的冗余部分。

大肠杆菌还存在可转位元件，导致遗传不稳定性。介导重组事件（如转座、水平基因转移）的可移动DNA 元件，包括插入序列元件（IS ）、转座酶、缺陷噬菌体、整合酶及位点特异性重组酶，散布在整个基因组中。即使没有转座酶，DNA 重复序列通过同源重组也会产生倒位、复制和删除。例如，MG1655含有10类44个可转位元件、6个拷贝的Rhs （一种类似转座子的重复序列，但没有数据指明其可以移动），基因组还含有8个原噬菌体或噬菌体残余。与可转位元件相关的转座酶可在应激状态下（如热激、冷激、电转等）被诱导。与转座子活性相关的基因组重排和突变在

［收稿日期］2008－12－04

［作者简介］方宏清（1966－），男，副研究员，博士研究生，

（E－mail）fanghongqing＠yahoo．com．cn

1大肠杆菌基因组减小的目的和意义

已测序的实验室菌株W3110与MG1655几乎完全相同，在蛋白编码区仅有8个位点存在差异[2]。更令人惊奇地是，在人类基因组序列草图中发现了大约18例转位元件（多为IS186、IS2、IS5），而在GenBank 数据库中更多。为了稳定基因组和代谢流，这些元件必须删除，不需要的功能（如与人体或特殊环境相关）必须去掉。很明显，一个稳定的菌株是生产及科学实验所需的。

一个可预测、可控制的细胞系统或称“细胞工厂”能够在代谢工程领域发挥更好的作用。在欧盟第五次框架计划（1998～

2002）中，曾实施了“细胞工厂”研究计划，以全面了解应用中的

微生物。该计划的主要成就之一是完成了枯草杆菌的分泌组研究。美国能源部在2002年开展了从基因组到生命（Genomes to

Life ，GTL ）的研究计划，目标是创建人工生命。GTL 计划的主要研

究内容之一是合成基因组。文特尔研究所（J．CraigVenter Insti-

tute ）在构建最小的基因组，用于能源和其他应用领域。在日本，

经工贸部和新能源及工业技术部在2001年启动了“最小基因组工厂”计划（Minimum Genome Factory ，MGF ），针对几种模式微生物开展基因组工程和功能基因组研究，构建具有较小基因组（只有必需基因）的微生物用于工业生产。此类最小基因组微生物是代谢工程和计算机模拟的理想平台。在此应说明，最小基因组并

方宏清等：大肠杆菌基因组减小研究进展

不是指一套最小、最基本的基因，而是指一套被选择的、适当的有工业用途的基因。

565

在另一项大肠杆菌最小基因组研究中[12－13]，原始设计删除区域是基于不影响大肠杆菌生长或基本代谢。通过比较大肠杆菌和Buchnera sp．（一种圆形原核生物，在蚜虫的细胞内共生）的基因组，选择大肠杆菌染色体上可有可无的区域。Buchnera sp．与大肠杆菌具有共同的祖先，在进化过程中这个共生体只保留了

2

2．1

最小基因组的研究策略

从头合成法

获得最小基因组细胞的最有效途径应该是合成生物学技

0．64Mb 的小基因组[14]。将在Buchnera sp．中不存在的区域作为

候选删除靶区。但Buchnera sp．缺少在M9培养基中生长所需的氨基酸、脂多糖和磷脂等合成基因。在保留了一些必需基因后，最后将大于含有10个连续非必需基因区作为候选删除区域，共选择了83个这样的区域。

此外，又将转座基因、插入序列和毒

素－抗毒素对也选择为待删除区域，这样又增加了20个。最终确定了103个候选删除区域，总长1830kb 。候选区域分别单独删除，然后通过P1转导累积到单个染色体中。每一个中间删除菌都要进行生长速率检测。如果某个新删除的基因影响生长，则从最小基因组设计中剔除。最终删除了1．03Mb ，基因组减小了

术。精确合成大DNA 分子的方法已建立。人工合成基因组的第一个例子是2002年报道的7440bp 的脊髓灰质炎病毒DNA [3]，耗时3年。2003报道的一种新方法，仅2周就合成了5386bp 的噬菌体基因组[4]。2008年报道成功合成582970bp 的支原体基因组[5]。随着DNA 合成技术的发展，合成更大的基因组成为可能。随之而来的问题将是如何使其成为一个可复制的基因组，成为一个真正的生命。

2．2应用基因组减小方法

基因组减小方法已在大肠杆菌、枯草杆菌、酵母等基因组上

22％。该菌株被命名为MGF－01。

得到实施。基因组减小可以减少代谢调节网络中的冗余，提高其预测性和可控性。此外，大肠杆菌基因组工程可以对基因组进行大规模修饰。如Posfai 等删除了大肠杆菌基因组内782个基因，包括所有可移动元件，以稳定其基因型[6]；Hashimoto 等将大肠杆菌基因组减小29．7％，只保留了3169个基因[7]。比较基因组杂交数据显示大肠杆菌染色体上的基因数目可以减至3000个[8]。根据目前的进展，通过基因组减小途径获得一个最小基因组工厂，要比合成基因组途径更快、更易实施。

3

3．1

基因组减小研究的常用方法

Red 重组技术与Sce Ⅰ切割筛选相结合[6,10]

见图1。敲除A 和B 之间的区域，首先PCR 构建一个线性

DNA 分子，包含两侧40～60bp 的同源区（A 、B 和C ），中间有一

个抗性基因（两边各有1个I－Sce Ⅰ酶切位点）；然后电转到靶细胞中，在Red 重组酶的作用下，通过同源区A 和C 发生双交叉置换，替代染色体片段。通过抗性筛选，经PCR 证实插入位点。注意置换后染色体上有2个B 区，同时抗性基因两侧各有1个I－Sce

2．3基因组删除区域的选择

一种是比较不同的大肠杆菌基因组序列。比较大肠杆菌

K12和O157∶H7的基因组[9]，发现一个惊人模式，成百上千的菌

株特异的“岛屿”插入共同的“骨架”中，完全相同的“骨架”中散布着完全不同的“岛屿”。根据菌株来源的不同，这些特异的岛屿被称为K 岛屿、O 岛屿和C 岛屿。MG1655的骨架基因组大小约

Ⅰ位点。最后诱导I－Sce Ⅰ酶表达，染色体在整合位置发生断裂，

然后通过RecA 介导的分子内重组修复断裂的双链。由于在断裂末端有一个短的同源B 区，重组修饰易于通过这些同源区发生。生存的菌落用PCR 筛选正确克隆。

这个方法的特点：靶向线性DNA 片段长度约1．7kb ，同源区A 、B 和C 的大小分别位40～80、40～60和40～45bp 。约200～

3．7Mb ，K 岛总和约为0．9Mb 。因此，删除所有K 岛将使基因组

减小20％。

假设某个区域只在其中一个菌株中存在，那么其功能在普通培养条件下是非必需的。Kolisnychenko 等[10]通过比较MG1655（K12）[1]和EDL933（O157:H7）的基因组[11]，选择了12个删除区域，包含11个大的K 岛和6个小岛。一般情况下，删除终点位于非编码区，与被删除的最近的开放读框（ORF ）相邻。由于引物设计的考虑，在少数情况下删除终点移到编码区，留下删除ORF 的

3＇端区域。删除后并未产生新的融合蛋白；8个删除区域中含有

隐蔽原噬菌体或噬菌体残余；删除区域含有高于平均水平的未知ORF 。所有删除操作都获得了成功，但不同区域插入效率差异很大，而且都低于其他文献报道。他们最后获得了MDS12菌株，基因组减小了8．1％。

在上述工作基础上，Posfai 等[6]通过一系列基因组序列比较识别存在于K12，但在其他5株大肠杆菌中不存在的序列，产生约100个删除（基因组的20％），编码900个基因。开始，删除大的岛、含有IS 的岛及含有IS 元件的个别基因。采用基于Red 重组系统的无痕删除技术。每一步删除都通过在基本培养基中的生长能力进行检验，然后通过P1转导将删除累积到单个菌株。通过测序及DNA 微阵列杂交验证删除端点。他们构建了不含可移动元件的基因组减小菌株MDS40－43，基因组减小了15％。

图1

Red－I－Sce Ⅰ

法无痕删除基因

566

500ng 的DNA 片段电转到MG1655中，可获得10～200个抗性

菌落，其中5％～90％在正确位点插入。相对较低的正确插入菌落数是该方法的限制因素。有报道，打靶DNA 片段内部存在与染色体序列同源的区域是引起低整合效率的原因。模板质粒

LETTERS IN BIOTECHNOLOGY

生物技术通讯

Vol．20No．4July, 2009

转座体（transposome ），按标准程序电转入MG1655中。应用抗性筛选标记选择转座子插入突变体，并将突变株基因组用Cla Ⅰ消化后用Southern 印迹确证只有一个转座子插入，插入位点及插入方向通过以Tn5内部引物直接进行基因组测序来鉴定。应用这种方法构建了2个各400个突变子库（分别为Km r 和Cm r ），然后通过P1转导获得双抗、含2个loxP 位点的菌株。表达Cre 重组酶诱导loxP 位点之间重组，2个位点之间序列被切除。可以继续通过P1转导将突变累积到单个菌株中，应用无痕敲除技术去掉抗性标记和loxP 位点。

pSG76－CS带有一个78bp 的IS1序列，被拷贝到打靶DNA 片

段。因为IS1在MG1655基因组中有7个拷贝，看起来会干扰整合过程。但是，将这个78bp 的同源区从质粒删除后得到质粒

pSG76－CSH，以其为模板构建打靶片段，并未观察到整合子数量

增加。删除区域大小为7～82kb ，与整合效率没有明显的相关性。

在第二个步骤，双链断裂修复效率较高。在I－Sce Ⅰ诱导表达后，10％～100％的存活细胞带有目标删除。染色体断裂末端应靠近B 区，否则重组修复会通过其他随机存在的短同源片段进行。在靶片段中含有2个I－Sce Ⅰ位点，会提高通过B 区的重组修复效率。RecA 在双链断裂重组修复过程中起主要作用，如

recA 基因缺失菌株就会丧失重组修复能力。3．2

应用两步Red 重组技术正负筛选[7]

该方法是采用2次Red 重组方法无痕删除靶基因。第1次重组以氯霉素抗性基因cat 为正筛选标记，替换染色体上靶区域；第2次重组以链霉素敏感的rpsL 和蔗糖敏感的sacB 基因为负筛选标记，消除筛选标记基因，从而获得无痕删除。采用2种负筛选标记的目的主要是提高阳性率。

图3应用Tn5靶向的Cre ／loxP 切除系统删除基因（OE 为转座酶外末端识别序列，b 表示基因位点标识

）

4基因组减小应用研究进展

Kolisnychenko 等

[10]

将MG1655基因组减小了8．1％，得到

MDS12菌株，没有改变其生长特性。但Hashimoto 等[7]将MG1655

基因组减少29．7％得到Δ16菌株，发现对生长及染色体分离有严重损害，Δ16菌株的类核组织表现异常，形态异常，且生长速率较低，代时为45．4min ，而原始菌代时为26．2min ，在M9基本培养基中不能生长。Posfai 等则完全删除了MG1655中的可移动元件，得到了MDS40、41、42和43[6]。

图2

两步Red 重组法无痕删除基因

这些基因组减小的菌株的生长速率与MG1655类似，复制弧长度的变化对此没有影响。MDS42的电转效率比MG1655高2个数量级，与DH10B 相当。

一些重组蛋白难以在大肠杆菌中表达，如霍乱毒素B 亚单位与兔出血热病毒VP60的融合蛋白（CTXVP60）。单独表达这2个基因的质粒在常用大肠杆菌宿主中都很稳定，但表达该融合蛋白的质粒pCTBXVP60在常用宿主中则不稳定，其原因是由于融合蛋白的表达提高了IS 转座频率。但在MDS 菌株中该融合蛋白能有效表达。MDS 菌株也适于其他重组蛋白的表达[6,16－17]。

在工业生产上，IS 转座使重要生产菌株的基因突变，从而需要重新构建生产菌株。在应激诱导下，IS 转座现象时有发生。如紫外线会诱导IS10转座，热激或蛋白过表达会诱导转座酶转录，营养缺乏也会诱导某些IS 元件转座。由于这类原因，商业购买的

3．3Tn5靶向的Cre ／loxP 切除系统

[15]

该方法是将Tn5转座突变技术、Cre ／loxP 切离系统和噬菌体

P1转导结合起来，创造了一种组合删除技术。带有loxP 重组位

点的改构Tn5转座子随机插入染色体的基因内。2个loxP 位点通过P1噬菌体转导作用带入同一个菌株中，然后由Cre 重组酶删除2个位点之间的序列。

首先构建转座子，以质粒pTnKloxP 和pTnCloxP 为模板，

PCR 扩增获得线性转座子TnKloxP 和TnCloxP ，分别含有抗性基

因（Km 和Cm ）、loxP 位点、两侧有超活性19bp 的外末端转座

r

r

酶识别序列（outer－endtransposase recognition sequence ，OE ）。

500ng 的转座子与10U Tn5转座酶在室温孵育30min ，形成

方宏清等：大肠杆菌基因组减小研究进展

质粒偶尔也会被污染，含有IS 序列（如IS1）的质粒在DH10B 宿主中培养时，质粒序列中常存在IS1、IS2、IS5和IS10插入。而在

567

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MDS40宿主中则没有此类现象发生[6]。

慢病毒载体含有较长的正向重复序列，在大肠杆菌中极不稳定，长末端重复序列（LTR ）之间的区域易丢失，难以获得真实克隆。Invitrogen 公司提供的菌株STBL3能够部分解决问题，但存在一些缺点，如生长慢、对噬菌体T1敏感、难以制备感受态。基因组减小菌株MDS40、41或42不含插入序列，能够降低质粒重组事件。MDS42的生长速率（代时为30min ）比STBL3快（代时为40min ）。用MDS42作为宿主可以提高慢病毒载体的稳定性，并提高载体的产量[18]。

应用无IS 序列的宿主菌MDS42可以提高质粒的稳定性，降低突变发生率，也可以表达一些毒性蛋白。这对蛋白药物、DNA 疫苗及基因治疗药物的生产意义重大。

Mizoguchi 等通过无痕敲除方法删除103个候选区域，有84

个删除突变株的生长行为与野生株类似。将这些删除累积起来构建了一个基因组减小菌株，通过28个循环将53个删除累积起来构建了MGF－01，并通过比较基因组杂交进行确证。他们共删除了1080个基因，包括125个未知功能基因，基因组长度减小了1．03Mb ，GC 含量增加了0．27％达到51．8％。MGF－01在M9基本培养基中的生长行为与出发菌W3110基本类似，但在培养后期的生长速度高于W3110，培养30h 后MGF－01的菌密度是

W3110的1．5倍。乙酸分析表明，MGF－01菌产生的乙酸不及野

生菌的一半，这可能是由于MGF－01具有较高的乙醛酸穿梭活性。DNA 微阵列分析表明，与W3110相比，MGF－01的异柠檬酸裂解酶和苹果酸合成酶基因的表达水平分别提高了6．9倍和4．7倍。此外，将合成苏氨酸的遗传单元（ΔmetA::thrABC－cat）整合到野生型和MGF－01的染色体上，在培养48h 后苏氨酸的产量分别为4．4和10．6g ／L 。以MGF－01为初始材料可以构建更好的

MGF 细胞，进一步改善其生长、代谢行为

[12－13]

。

5结语

由于遗传学背景较清楚、生长速度快、培养基条件要求较

低等特点，长期以来，大肠杆菌都是商业生产上最常用的表达系统。改造大肠杆菌用于制备传统的化学品或中间体是当前的研究热点之一。在自然界中存在着丰富的药用化合物资源，常常蕴藏着化学合成难以实现的结构，如氨基莽草酸、青蒿素等。直接从天然植物中提取受限于原料来源、产地等诸多因素的限制，而通过改造大肠杆菌可以生产氨基莽草酸[19]和青蒿素[20]。

大肠杆菌基因组改造技术已日趋成熟。通过基因组减小研究，不仅能够帮助理解基因的功能，而且还可以构建一个“干净”的宿主，以维持外源基因稳定性，适于大规模培养。这样的宿主在重组蛋白表达、基因治疗或疫苗载体的制备，以及药用化合物和大宗化学品的制备等方面具有重要应用前景。

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