免疫学杂志2015年10月第31卷第10期IMMUNOLOGICALJOURNALVol.31No.10Oct.2015·897·
·论著·
[文章编号]1000-8861（2015）10-0897-05；[DOI]10.13431/j.cnki.immunol.j.20150189
荧光微球时间分辨免疫层析技术定量检测甲胎蛋白的研究
郭明明，周
[摘
衍，周剑波，俞静文，陈燕，范俊，黄飚*
要]目的建立荧光微球时间分辨免疫层析技术检测血清中甲胎蛋白（AFP）的反应体系并对该法进行评价。方法以包裹
有Eu螯合物的荧光微球作为标记物，共价偶联抗AFP的单克隆抗体AC18#，将抗AFP单克隆抗体AC17#和羊抗鼠抗体喷涂于硝酸纤维素膜上分别作为检测线和质控线，制作免疫层析试纸条。结果标准曲线经Log-LogB函数处理，检测AFP的线性范围为
0.03～1000U/ml，批内和批间变异系数（CV）分别为5.35%和8.94%，平均回收率为98.45%。该法检测100例健康人员的AFP水平
为（2.04±1.92）U/ml，正常参考值为5.80U/ml，与时间分辨免疫分析法(TRFIA)检测AFP有较好的相关性，r=0.978(P
[关键词]荧光微球；时间分辨；免疫层析；甲胎蛋白[中图分类号]R735.7
[文献标识码]A
Quantitationofalphafetoprotein(AFP)inhumanserumusingfluorescencemicrospherestime-resolvedimmunochromatographictechnology
GUOMingming1,ZHOUYan1,ZHOUJianbo2,YUJingwen2,CHENYan2,FANJun1,HUANGBiao1,*
1.KeyLaboratoryofNuclearMedicine,MinistryofHealth&JiangsuKeyLaboratoryofMolecularNuclearMedicine,JiangsuInstituteofNuclearMedicine,Wuxi214063,China;2.DepartmentofClinicalLaboratory,JiangyinPeople'sHospital,Jiangyin214400,China
*CorrespondingAuthor:HUANGBiao,E-mail:[email protected]
[Abstract]Thisstudywasdesignedtodevelopafluorescentmicrospherestime-resolvedimmunochromatographicassayfordetectionofalphafetoprotein(AFP)inhumanserum,andtoevaluatethemethodperformance.TheEu-time-resolvedfluorescentpolystyreneparticleconjugatedwiththemonoclonalantibodyAC18#wasusedasafluorescentlabel.ThemonoclonalantibodyAC17#andgoatanti-mouseIgGwereimmobilizedonthenitrocellulosemembraneasthetestlineandcontrolline.ThelinearresponserangeofthemethodtodetecttheserumAFPwas0.03-1000U/ml.Andtheintra-andinter-assaycoefficientwere5.35%and8.94%,respectively,whileaveragerecoveryratewas98.45%.Themeansof100healthyvolunteerswas(2.04±1.92)U/ml,thusthenormalrangesofserumAFPlevelswerelessthan5.80U/ml.Measurementsobtainedbythefluorescentmicrospherestime-resolvedimmunochromatographicstripshowedacorrelationcoefficient(r)of0.978(P
[Keywords]Fluorescentmicrospheres;Time-resolved;Immunochromatographic;Alphafetoprotein
肝癌是我国最常见、最具有危害性的恶性肿瘤之一，其5年生存率不足10%[1-2]，临床上常用甲胎蛋白（AFP）对肝癌进行早期诊断及治疗监测。AFP是人类发现的第1个真正有价值的肿瘤标志物，从70年代开始，便应用于原发性肝癌（HCC）的诊断[3]，AFP血
基金项目：江苏省卫生计生委科研课题（Z201506）
作者单位：214063无锡，江苏省原子医学研究所卫生部核医学重点实验室江苏省分子核医学重点实验室（郭明明，周衍，范俊，黄飚）；
清学检查被认为是诊断和发现HCC的重要手段。
AFP是正常细胞在幼稚阶段的产物，成人合成AFP的基因基本处于静止状态，血清中AFP的平均质量
浓度≤20μg/L。在妊娠、内胚源性肿瘤及肝脏病变时，血清AFP会有不同程度的升高。
214400，江阴市人民医院检验科（周剑波，俞静文，陈燕）
*通信作者：黄飚，Tel：0510-85220770，E-mail：[email protected]
AFP的传统免疫检测手段有放射免疫分析（RIA）、酶联免疫分析（ELISA）及化学发光免疫分析（CLIA）等，但这些方法或步骤繁琐、耗时，或检测费用昂贵。时间分辨免疫荧光（TRFIA）具有灵敏度高、
·898·免疫学杂志2015年10月第31卷第10期IMMUNOLOGICALJOURNALVol.31No.10Oct.2015
特异性强、稳定性好的特点，是目前取代放射性免疫分析的一种定量方法，在国内逐渐普及，但该法操作步骤复杂，且以试剂盒形式使用，不适合单人份。荧光微球是指直径在纳米至微米级（0.01～10μm）范围内负载有荧光物质，受外界能量刺激能激发出荧光的固体微粒。由于具有相对稳定的形态结构及发光行为，发射强而稳定，基本不受外界环境介质变化的影响等优点[4]，使荧光微球免疫层析法有较好的应用前景。目前，该技术已经应用在莱克多巴胺[5]、大肠杆菌
免疫微球，具体方法：4℃保存的10g/LEu-时间分辨荧光微球经超声重悬后，取250μl于1.5mlEP管中，室温1.4×104r/min离心15min，弃上清，加入600μl
MES活化缓冲液(pH4.5)洗涤2次后加入400μl活
化缓冲液，再加入50μl50g/L的EDC和50μl50g/L的NHS，室温下避光震荡30min，活化缓冲液洗涤，用0.05mol/LPBS(pH7.2)重悬至1ml后均分成
O157：H7[6]、金黄色葡萄球菌肠菌素B[7]、酪蛋白[8]等的
检测中，并展示了明显优势。
本文将表面羧基化修饰的包裹有Eu螯合物的荧光微球与抗体表面的氨基共价结合，形成免疫标记复合物，将抗AFP单克隆抗体AC17#和羊抗鼠抗体喷涂于硝酸纤维素膜上分别作为检测线和质控线。根据双抗体夹心法，构建了AFP的荧光微球时间分辨免疫层析检测体系，实现了血清中AFP的快速检测，特异性好、成本低廉、操作简便，既可满足临床大规模肝癌的普查，也可单人份操作，便于应用和推广。
5管，分别加入相应量的AFPMcAbAC18#，补充PBS终体积至400μl，室温下避光震荡2h。分别加入5μl封闭剂（10%BSA，0.05mol/LPBS，pH7.2），室温下避
光震荡30min，1.4×104r/min离心15min，弃上清，用去离子水洗涤标记微球。最后用含有1%BSA，0.1%
Tween-20，0.05mol/LPBS(pH7.2)分别重悬至200μl，4℃避光保存备用。
1.4荧光免疫层析试纸条的组装在湿度小于35%，稳定20～25℃的环境下，将聚氯乙烯底板上黏贴样品垫和吸水纸形成微滤体系，然后将其切割成0.4cm
宽，即成试纸条（图1），将试纸条装入卡壳中制成卡条，装入铝膜袋封存备用。
1材料与方法
1.1材料与试剂AFP单克隆抗体(AFPMcAb)AC17#和AC18#、AFP参考标准品、羊抗鼠抗体、质控标记微
球、AFP-TRFIA试剂盒（无锡市江原实业技贸总公司）；BM100010-Eu-时间分辨荧光纳米微球（上海西宝生物公司）；吸水纸、样品垫、硝酸纤维素膜（上海杰一公司）；1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）购自
图1荧光微球时间分辨免疫层析检测AFP结构示意图
Fig1Theschematicdiagramoffluorescentmicrospherestime-resolvedimmunochromatographicstripfor
AFP
1.5测定方法的优化采用双抗体夹心法建立测定
方法，并对1.3中的标记微球、加样量、检测时间进行选择。即在包被有抗体的卡条上的加样区加入一定量的参考标准（0、1、10、100、500、1000U/ml）或待测样本，再加入50μl按体积比1%稀释的标记微球
Sigma公司；HG-98免疫定量分析仪（上海互帼公司）；
全自动TRFIA检测仪
DELFIA1235（Perkin-Elmer
公司）；5417R型离心机（Eppendorf公司）；切条机和
Auto
喷膜机购自杭州赛凯生物公司；超声仪购自深圳洁康公司。其他试剂均为国产分析纯。临床血清标本来自江原医院，健康对照组血清收集自无肝病史，且肝肾生化指标正常的健康体检人员，异常组血样收集于经时间分辨测定及罗氏E170电化学发光免疫分析仪复查均异常的人员（包括孕妇、乙肝携带者及肝癌患者）。
AFPMcAbAC18#（稀释液含质控标记微球），室温下
静置一段时间，开启荧光检测设备，并将检测条及校准卡插入荧光检测设备的插卡口，运行仪器，标准曲线由双对数函数数学模型处理给出，软件由本实验室自编。
1.2制备包被膜在聚氯乙烯底板上黏贴上包被膜,使用含1%蔗糖的0.02mol/L的PBS(pH7.4)，将检测
抗体AFPMcAbAC17#和质控抗体稀释至0.75g/L，将二者以0.5cm的间隔喷于硝酸纤维素膜上，30℃烘箱中放置3h后装入铝膜袋封存备用。
1.6方法学考核
1.6.1灵敏度灵敏度是指分析方法的最小检出量，以10组标准曲线零管计数求得平均值（）和标准差
（s），计算+2s，在标准曲线上找到对应浓度。
1.3抗体标记微球参照说明书操作，分别按抗体/微球质量比为1∶200、1∶100、1∶50、1∶25、1∶12.5标记200μl
1.6.2特异性考察抗体与被测物质的交叉反应程度，以高浓度的CA199（400U/ml）、CA242（200U/ml）、CEA（500μg/L）作为样本测量，分析AFP抗体的
免疫学杂志2015年10月第31卷第10期IMMUNOLOGICALJOURNALVol.31No.10Oct.2015·899·
特异性。
1.6.3回收率在已知浓度的样本(S)中加入低、中、高
浓度的质控(q)，按检测方法测定样本浓度（m），计算实测值与理论值的比值。
1.6.4精密度选择低、中、高3组样本进行精密度试验。考察批内精密度时，3个标准各设7个复管；考察批间精密度时，3个标准各测3次，每次各设7个复
管，计算检测AFP浓度的平均值、标准差及变异系数（CV）。
图3加样量对检测结果的影响
1.6.5与AFP-TRFIA试剂盒比较严格按照AFP-TRFIA试剂盒说明书操作，与AFP-荧光微球时间分辨免疫层析试纸分别同时做55例样本，将TRFIA与
荧光微球时间分辨免疫层析法进行相关性分析。
Fig3Analysiswithdifferentquantityof
sample
2.1.3检测时间的选择在卡条加样区加入20μl的参考标准，再加入50μl稀释的标记微球，室温下静
置，分别在5、10、15、20、25、30min时检测，考察检测时间对结果的影响，结果见图4。随检测时间的延长，各浓度点的结合率基本呈现增加的趋势。试纸条静置15min检测时即能达到较高的结合率，而随着检测时间增加，各浓度点的结合率不再发生较大的变化，趋于平稳。说明在15min时，试纸条上的双抗体夹心吸附基本达到饱和。因此，本着快速简便的原则，选择检测时间为15min。
综上所述，本研究建立的荧光微球时间分辨免疫层析试纸条以20μl为加样量，50μl经稀释的标记比例为1∶25的免疫微球为上样溶液，加样后15min检测。
1.7统计学分析用SPSS17.0统计软件对数据进行分析，组间用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。用配对T检验进行相关性和差异性比较。
2结果
2.1测定条件的选择
2.1.1标记量的选择在卡条加样区分别加入20μl的参考标准后，加入50μl不同标记浓度的稀释微球，室温下静置20min，检测，考察并验证不同标记
量对检测结果的影响，结果见图2。随抗体标记浓度的增加，各浓度点的结合率呈现先增后降的趋势，在抗体/微球的质量比为1∶25时有最大值。因此，选择标记比例为1∶25的免疫微球进行后续实验。
2.1.2加样量的选择在其它条件一致的情况下，考
察并验证不同加样量对检测结果的影响。在卡条加样区分别加入10、15、20、25μl的参考标准，室温下静置20min，检测，结果见图3。随上样量的增加，各浓度点的结合率均增大。加样量为20μl时，继续增加上样量，结合率增加不明显，可认为试纸条上的双抗体夹心吸附基本达到饱和，因此后续选择20μl加样量进行实验。
图4检测时间对检测结果的影响
Fig4Analysiswithdifferenttime
2.2检测结果的判读加样后，由于层析作用液体向
前移动，先后与包被在T线和C线上的抗体形成复合物，这时，试纸条经荧光检测设备扫描显示2条荧光条带（图5）。C线荧光扫描值基本一致，T线值随加样中AFP浓度的增加而升高。相应的检测结果以浓度为横坐标，荧光值信号为纵坐标，经对数函数数据处理程序拟合所得标准曲线见图6。样本为阴性时，
图2抗体标记量对检测结果的影响
Fig2Analysiswithdifferentcouplingratio
AFP浓度很低，T线荧光值很低或完全检测不到；样本为阳性时，AFP浓度越高T线荧光值越高。无论是阳性还是阴性结果，C线总能显示荧光，如果C
线没
·900·免疫学杂志2015年10月第31卷第10期IMMUNOLOGICALJOURNALVol.31No.10Oct.2015
表2荧光微球免疫层析技术检测AFP的回收率试验
有荧光显线，无论T线有无，这时的结果均无效。
Tab2RecoveryofAFPbythefluorescentmicrospherestime-resolvedimmunochromatographicstrip
q/(U·ml-1)m/(U·ml-1)Recovery/%S/Average-1
(U·ml)LowMediumHighLowMediumHigh
LowMediumHighrecovery/%20.8022.9767.25163.9041.6089.47182.1595.08101.6198.62
98.45
S:Concentrationofthesample;q:Concentrationofthequalitycontrol;m:Testedconcentrationofthesample.
图5荧光微球免疫层析技术检测AFP的扫描图谱
Fig5Scanningmapoffluorescentmicrospherestime-resolved
immunochromatographicstripfor
AFP
2.3.3特异性采用荧光微球时间分辨荧光免疫分析法检测CA199浓度在400U/ml时测定值为0.2U/ml，CA242浓度在200U/ml时测定值为0.05U/ml，CEA质量浓度在500μg/L时测定值为0.12μg/L，说
明试纸条与CA199、CA242及CEA之间无交叉反应，抗体特异性比较好。
2.4临床血清样本分析分别用荧光微球时间分辨
免疫分析试纸和AFP-TRFIA试剂盒对55份临床血清样本进行检测，并作比较（图7），从图7可以看出，
y=0.96x+7.04，r=0.98。荧光微球时间分辨免疫分析法
与TRFIA法测定血清中AFP结果高度相关，具有很好的一致性，P值小于0.001，相关性具有统计学意
图6荧光微球免疫层析技术检测AFP的标准曲线
义。采用荧光微球时间分辨免疫分析法测定100例健康体检人员血清中AFP为（2.04±1.92）U/ml，所有样本按95%正常值范围，单侧确定正常参考值为
Fig6Calibrationcurveofthefluorescentmicrospherestime-resolvedimmunochromatographicstripforAFP
2.3荧光免疫层析技术检测AFP的方法学评价
2.3.1灵敏度和稳定性以零浓度点计数（cps，+2s）
的计数率在标准曲线上所得到的相应浓度值为检测的灵敏度，可知本方法的灵敏度为0.03U/ml。试剂盒于4℃，避光条件下保存6个月后测定，各浓度点的结合率平均下降4.6%，说明试剂盒稳定性较好，货架期较长。
2.04+1.96×1.92=5.80U/ml。
2.3.2精密度和回收率采用荧光微球时间分辨免疫层析法测定血清中AFP，低、中、高3种浓度的20次批内和批间CV分别为4.34%～6.41%和5.00%～11.62%（表1），平均CV分别为5.35%和8.94%，符合
批内CV
n=55.
图7TRFIA法测定AFP与荧光微球时间分辨免疫层析
技术测定AFP的相关试验
3组添加样本的平均回收率为98.45%，见表2。
表1荧光微球免疫层析技术检测AFP的精密度试验
Fig7CorrelationbetweentheTRFIAandFluorescenceimmunochromatographicstripforAFPinhumanserum
Tab1AssaycoefficientofAFPbythefluorescentmicrospherestime-resolvedimmunochromatographicstrip
AssaycoefficientIntra-assaycoefficient
CV/%Inter-assaycoefficient
CV/%
Sample
Low29.83±1.595.3030.04±3.4911.62
Medium6.4110.20
Hight4.345.00
107.01±6.86548.42±23.78104.53±10.67551.54±27.58
3讨论
肝癌发病率高、死亡率高，在确诊时大部分已属晚期或远端转移。如果可以早发现、早治疗，其5年生存率会大大提高，甚至可以治愈[9]。肝癌常规检测筛查指标主要有血清AFP和影像学检查（B超、CT检查）。有研究发现，在AFP阳性的HCC患者中，
AFP
免疫学杂志2015年10月第31卷第10期IMMUNOLOGICALJOURNALVol.31No.10Oct.2015
[2][3]
·901·
可在症状出现前8～11个月即可升高[10]。更有临床病例显示，血清AFP升高可早于肝癌影像诊断38个月[11]。因此相对于肝脏影像学检查，血清学检查灵敏度更高，更为简单易行，对肝癌的检测诊断更有价值。
目前，临床检测血清中AFP的方法有几种，各有优缺点。CLIA结果准确但试剂大多需要进口，检测
[12]
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费用昂贵。TRFIA作为一种超微量检测技术，检测限在10-18mol/L，高于ELISA的10-10mol/L和RIA的
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刘道峰,邓省亮,赖卫华,等.莱克多巴胺荧光微球免疫层析检测方法的建立[J].食品与机械,2012,28(1):73-77.
10-12mol/L，在国内医院逐渐普及，但仍需要较为大型
的检测仪器，且不能单人份操作，不适用于基层医院。荧光微球免疫层析技术近年来发展迅速，但其荧光强度高的同时背景荧光亦高，特异性欠佳。本研究采用荧光微球时间分辨免疫层析技术，采用包裹有镧系元素（Eu）螯合物的荧光纳米微球作为标记示踪，结合了镧族元素荧光的长寿命和纳米微球的信号放大效应，荧光强度高，且荧光的发射光谱峰范围窄，检测特异性好；激发光和发射光的stokes位移大，激发光不能直接到达光电接受器，解决激发光的杂散光影响，大幅度提高了检测的灵敏度和稳定性；荧光寿命长，通过延缓测量时间，短寿命的背景荧光衰变消失后，再记录特异性的荧光，完全避免了背景荧光的干扰。
本研究建立了以血清中AFP为目的物的荧光微球时间分辨免疫层析检测方法，结合了时间分辨荧光微球高灵敏度、高特异性和免疫层析技术可进行单份标本检测、简便快速的优势[13-14]，最终检测限可达
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出实验结果；配套荧光检测仪经济、小型，更加适合基层单位；既利于大规模临床样本普查筛选和患者病情的监测，又可单人份操作。荧光微球时间分辨免疫层析作为一种灵敏、快速、经济、简便的血清AFP检测方法，具有非常好的推广应用价值。
380-383.
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【参考文献】
[1]
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（收稿日期：2015-07-02；修回日期：2015-07-22）
（编辑侯瑞）
免疫学杂志2015年10月第31卷第10期IMMUNOLOGICALJOURNALVol.31No.10Oct.2015·897·
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[关键词]荧光微球；时间分辨；免疫层析；甲胎蛋白[中图分类号]R735.7
[文献标识码]A
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GUOMingming1,ZHOUYan1,ZHOUJianbo2,YUJingwen2,CHENYan2,FANJun1,HUANGBiao1,*
1.KeyLaboratoryofNuclearMedicine,MinistryofHealth&JiangsuKeyLaboratoryofMolecularNuclearMedicine,JiangsuInstituteofNuclearMedicine,Wuxi214063,China;2.DepartmentofClinicalLaboratory,JiangyinPeople'sHospital,Jiangyin214400,China
*CorrespondingAuthor:HUANGBiao,E-mail:[email protected]
[Abstract]Thisstudywasdesignedtodevelopafluorescentmicrospherestime-resolvedimmunochromatographicassayfordetectionofalphafetoprotein(AFP)inhumanserum,andtoevaluatethemethodperformance.TheEu-time-resolvedfluorescentpolystyreneparticleconjugatedwiththemonoclonalantibodyAC18#wasusedasafluorescentlabel.ThemonoclonalantibodyAC17#andgoatanti-mouseIgGwereimmobilizedonthenitrocellulosemembraneasthetestlineandcontrolline.ThelinearresponserangeofthemethodtodetecttheserumAFPwas0.03-1000U/ml.Andtheintra-andinter-assaycoefficientwere5.35%and8.94%,respectively,whileaveragerecoveryratewas98.45%.Themeansof100healthyvolunteerswas(2.04±1.92)U/ml,thusthenormalrangesofserumAFPlevelswerelessthan5.80U/ml.Measurementsobtainedbythefluorescentmicrospherestime-resolvedimmunochromatographicstripshowedacorrelationcoefficient(r)of0.978(P
[Keywords]Fluorescentmicrospheres;Time-resolved;Immunochromatographic;Alphafetoprotein
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作者单位：214063无锡，江苏省原子医学研究所卫生部核医学重点实验室江苏省分子核医学重点实验室（郭明明，周衍，范俊，黄飚）；
清学检查被认为是诊断和发现HCC的重要手段。
AFP是正常细胞在幼稚阶段的产物，成人合成AFP的基因基本处于静止状态，血清中AFP的平均质量
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214400，江阴市人民医院检验科（周剑波，俞静文，陈燕）
*通信作者：黄飚，Tel：0510-85220770，E-mail：[email protected]
AFP的传统免疫检测手段有放射免疫分析（RIA）、酶联免疫分析（ELISA）及化学发光免疫分析（CLIA）等，但这些方法或步骤繁琐、耗时，或检测费用昂贵。时间分辨免疫荧光（TRFIA）具有灵敏度高、
·898·免疫学杂志2015年10月第31卷第10期IMMUNOLOGICALJOURNALVol.31No.10Oct.2015
特异性强、稳定性好的特点，是目前取代放射性免疫分析的一种定量方法，在国内逐渐普及，但该法操作步骤复杂，且以试剂盒形式使用，不适合单人份。荧光微球是指直径在纳米至微米级（0.01～10μm）范围内负载有荧光物质，受外界能量刺激能激发出荧光的固体微粒。由于具有相对稳定的形态结构及发光行为，发射强而稳定，基本不受外界环境介质变化的影响等优点[4]，使荧光微球免疫层析法有较好的应用前景。目前，该技术已经应用在莱克多巴胺[5]、大肠杆菌
免疫微球，具体方法：4℃保存的10g/LEu-时间分辨荧光微球经超声重悬后，取250μl于1.5mlEP管中，室温1.4×104r/min离心15min，弃上清，加入600μl
MES活化缓冲液(pH4.5)洗涤2次后加入400μl活
化缓冲液，再加入50μl50g/L的EDC和50μl50g/L的NHS，室温下避光震荡30min，活化缓冲液洗涤，用0.05mol/LPBS(pH7.2)重悬至1ml后均分成
O157：H7[6]、金黄色葡萄球菌肠菌素B[7]、酪蛋白[8]等的
检测中，并展示了明显优势。
本文将表面羧基化修饰的包裹有Eu螯合物的荧光微球与抗体表面的氨基共价结合，形成免疫标记复合物，将抗AFP单克隆抗体AC17#和羊抗鼠抗体喷涂于硝酸纤维素膜上分别作为检测线和质控线。根据双抗体夹心法，构建了AFP的荧光微球时间分辨免疫层析检测体系，实现了血清中AFP的快速检测，特异性好、成本低廉、操作简便，既可满足临床大规模肝癌的普查，也可单人份操作，便于应用和推广。
5管，分别加入相应量的AFPMcAbAC18#，补充PBS终体积至400μl，室温下避光震荡2h。分别加入5μl封闭剂（10%BSA，0.05mol/LPBS，pH7.2），室温下避
光震荡30min，1.4×104r/min离心15min，弃上清，用去离子水洗涤标记微球。最后用含有1%BSA，0.1%
Tween-20，0.05mol/LPBS(pH7.2)分别重悬至200μl，4℃避光保存备用。
1.4荧光免疫层析试纸条的组装在湿度小于35%，稳定20～25℃的环境下，将聚氯乙烯底板上黏贴样品垫和吸水纸形成微滤体系，然后将其切割成0.4cm
宽，即成试纸条（图1），将试纸条装入卡壳中制成卡条，装入铝膜袋封存备用。
1材料与方法
1.1材料与试剂AFP单克隆抗体(AFPMcAb)AC17#和AC18#、AFP参考标准品、羊抗鼠抗体、质控标记微
球、AFP-TRFIA试剂盒（无锡市江原实业技贸总公司）；BM100010-Eu-时间分辨荧光纳米微球（上海西宝生物公司）；吸水纸、样品垫、硝酸纤维素膜（上海杰一公司）；1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）购自
图1荧光微球时间分辨免疫层析检测AFP结构示意图
Fig1Theschematicdiagramoffluorescentmicrospherestime-resolvedimmunochromatographicstripfor
AFP
1.5测定方法的优化采用双抗体夹心法建立测定
方法，并对1.3中的标记微球、加样量、检测时间进行选择。即在包被有抗体的卡条上的加样区加入一定量的参考标准（0、1、10、100、500、1000U/ml）或待测样本，再加入50μl按体积比1%稀释的标记微球
Sigma公司；HG-98免疫定量分析仪（上海互帼公司）；
全自动TRFIA检测仪
DELFIA1235（Perkin-Elmer
公司）；5417R型离心机（Eppendorf公司）；切条机和
Auto
喷膜机购自杭州赛凯生物公司；超声仪购自深圳洁康公司。其他试剂均为国产分析纯。临床血清标本来自江原医院，健康对照组血清收集自无肝病史，且肝肾生化指标正常的健康体检人员，异常组血样收集于经时间分辨测定及罗氏E170电化学发光免疫分析仪复查均异常的人员（包括孕妇、乙肝携带者及肝癌患者）。
AFPMcAbAC18#（稀释液含质控标记微球），室温下
静置一段时间，开启荧光检测设备，并将检测条及校准卡插入荧光检测设备的插卡口，运行仪器，标准曲线由双对数函数数学模型处理给出，软件由本实验室自编。
1.2制备包被膜在聚氯乙烯底板上黏贴上包被膜,使用含1%蔗糖的0.02mol/L的PBS(pH7.4)，将检测
抗体AFPMcAbAC17#和质控抗体稀释至0.75g/L，将二者以0.5cm的间隔喷于硝酸纤维素膜上，30℃烘箱中放置3h后装入铝膜袋封存备用。
1.6方法学考核
1.6.1灵敏度灵敏度是指分析方法的最小检出量，以10组标准曲线零管计数求得平均值（）和标准差
（s），计算+2s，在标准曲线上找到对应浓度。
1.3抗体标记微球参照说明书操作，分别按抗体/微球质量比为1∶200、1∶100、1∶50、1∶25、1∶12.5标记200μl
1.6.2特异性考察抗体与被测物质的交叉反应程度，以高浓度的CA199（400U/ml）、CA242（200U/ml）、CEA（500μg/L）作为样本测量，分析AFP抗体的
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特异性。
1.6.3回收率在已知浓度的样本(S)中加入低、中、高
浓度的质控(q)，按检测方法测定样本浓度（m），计算实测值与理论值的比值。
1.6.4精密度选择低、中、高3组样本进行精密度试验。考察批内精密度时，3个标准各设7个复管；考察批间精密度时，3个标准各测3次，每次各设7个复
管，计算检测AFP浓度的平均值、标准差及变异系数（CV）。
图3加样量对检测结果的影响
1.6.5与AFP-TRFIA试剂盒比较严格按照AFP-TRFIA试剂盒说明书操作，与AFP-荧光微球时间分辨免疫层析试纸分别同时做55例样本，将TRFIA与
荧光微球时间分辨免疫层析法进行相关性分析。
Fig3Analysiswithdifferentquantityof
sample
2.1.3检测时间的选择在卡条加样区加入20μl的参考标准，再加入50μl稀释的标记微球，室温下静
置，分别在5、10、15、20、25、30min时检测，考察检测时间对结果的影响，结果见图4。随检测时间的延长，各浓度点的结合率基本呈现增加的趋势。试纸条静置15min检测时即能达到较高的结合率，而随着检测时间增加，各浓度点的结合率不再发生较大的变化，趋于平稳。说明在15min时，试纸条上的双抗体夹心吸附基本达到饱和。因此，本着快速简便的原则，选择检测时间为15min。
综上所述，本研究建立的荧光微球时间分辨免疫层析试纸条以20μl为加样量，50μl经稀释的标记比例为1∶25的免疫微球为上样溶液，加样后15min检测。
1.7统计学分析用SPSS17.0统计软件对数据进行分析，组间用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。用配对T检验进行相关性和差异性比较。
2结果
2.1测定条件的选择
2.1.1标记量的选择在卡条加样区分别加入20μl的参考标准后，加入50μl不同标记浓度的稀释微球，室温下静置20min，检测，考察并验证不同标记
量对检测结果的影响，结果见图2。随抗体标记浓度的增加，各浓度点的结合率呈现先增后降的趋势，在抗体/微球的质量比为1∶25时有最大值。因此，选择标记比例为1∶25的免疫微球进行后续实验。
2.1.2加样量的选择在其它条件一致的情况下，考
察并验证不同加样量对检测结果的影响。在卡条加样区分别加入10、15、20、25μl的参考标准，室温下静置20min，检测，结果见图3。随上样量的增加，各浓度点的结合率均增大。加样量为20μl时，继续增加上样量，结合率增加不明显，可认为试纸条上的双抗体夹心吸附基本达到饱和，因此后续选择20μl加样量进行实验。
图4检测时间对检测结果的影响
Fig4Analysiswithdifferenttime
2.2检测结果的判读加样后，由于层析作用液体向
前移动，先后与包被在T线和C线上的抗体形成复合物，这时，试纸条经荧光检测设备扫描显示2条荧光条带（图5）。C线荧光扫描值基本一致，T线值随加样中AFP浓度的增加而升高。相应的检测结果以浓度为横坐标，荧光值信号为纵坐标，经对数函数数据处理程序拟合所得标准曲线见图6。样本为阴性时，
图2抗体标记量对检测结果的影响
Fig2Analysiswithdifferentcouplingratio
AFP浓度很低，T线荧光值很低或完全检测不到；样本为阳性时，AFP浓度越高T线荧光值越高。无论是阳性还是阴性结果，C线总能显示荧光，如果C
线没
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表2荧光微球免疫层析技术检测AFP的回收率试验
有荧光显线，无论T线有无，这时的结果均无效。
Tab2RecoveryofAFPbythefluorescentmicrospherestime-resolvedimmunochromatographicstrip
q/(U·ml-1)m/(U·ml-1)Recovery/%S/Average-1
(U·ml)LowMediumHighLowMediumHigh
LowMediumHighrecovery/%20.8022.9767.25163.9041.6089.47182.1595.08101.6198.62
98.45
S:Concentrationofthesample;q:Concentrationofthequalitycontrol;m:Testedconcentrationofthesample.
图5荧光微球免疫层析技术检测AFP的扫描图谱
Fig5Scanningmapoffluorescentmicrospherestime-resolved
immunochromatographicstripfor
AFP
2.3.3特异性采用荧光微球时间分辨荧光免疫分析法检测CA199浓度在400U/ml时测定值为0.2U/ml，CA242浓度在200U/ml时测定值为0.05U/ml，CEA质量浓度在500μg/L时测定值为0.12μg/L，说
明试纸条与CA199、CA242及CEA之间无交叉反应，抗体特异性比较好。
2.4临床血清样本分析分别用荧光微球时间分辨
免疫分析试纸和AFP-TRFIA试剂盒对55份临床血清样本进行检测，并作比较（图7），从图7可以看出，
y=0.96x+7.04，r=0.98。荧光微球时间分辨免疫分析法
与TRFIA法测定血清中AFP结果高度相关，具有很好的一致性，P值小于0.001，相关性具有统计学意
图6荧光微球免疫层析技术检测AFP的标准曲线
义。采用荧光微球时间分辨免疫分析法测定100例健康体检人员血清中AFP为（2.04±1.92）U/ml，所有样本按95%正常值范围，单侧确定正常参考值为
Fig6Calibrationcurveofthefluorescentmicrospherestime-resolvedimmunochromatographicstripforAFP
2.3荧光免疫层析技术检测AFP的方法学评价
2.3.1灵敏度和稳定性以零浓度点计数（cps，+2s）
的计数率在标准曲线上所得到的相应浓度值为检测的灵敏度，可知本方法的灵敏度为0.03U/ml。试剂盒于4℃，避光条件下保存6个月后测定，各浓度点的结合率平均下降4.6%，说明试剂盒稳定性较好，货架期较长。
2.04+1.96×1.92=5.80U/ml。
2.3.2精密度和回收率采用荧光微球时间分辨免疫层析法测定血清中AFP，低、中、高3种浓度的20次批内和批间CV分别为4.34%～6.41%和5.00%～11.62%（表1），平均CV分别为5.35%和8.94%，符合
批内CV
n=55.
图7TRFIA法测定AFP与荧光微球时间分辨免疫层析
技术测定AFP的相关试验
3组添加样本的平均回收率为98.45%，见表2。
表1荧光微球免疫层析技术检测AFP的精密度试验
Fig7CorrelationbetweentheTRFIAandFluorescenceimmunochromatographicstripforAFPinhumanserum
Tab1AssaycoefficientofAFPbythefluorescentmicrospherestime-resolvedimmunochromatographicstrip
AssaycoefficientIntra-assaycoefficient
CV/%Inter-assaycoefficient
CV/%
Sample
Low29.83±1.595.3030.04±3.4911.62
Medium6.4110.20
Hight4.345.00
107.01±6.86548.42±23.78104.53±10.67551.54±27.58
3讨论
肝癌发病率高、死亡率高，在确诊时大部分已属晚期或远端转移。如果可以早发现、早治疗，其5年生存率会大大提高，甚至可以治愈[9]。肝癌常规检测筛查指标主要有血清AFP和影像学检查（B超、CT检查）。有研究发现，在AFP阳性的HCC患者中，
AFP
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[2][3]
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可在症状出现前8～11个月即可升高[10]。更有临床病例显示，血清AFP升高可早于肝癌影像诊断38个月[11]。因此相对于肝脏影像学检查，血清学检查灵敏度更高，更为简单易行，对肝癌的检测诊断更有价值。
目前，临床检测血清中AFP的方法有几种，各有优缺点。CLIA结果准确但试剂大多需要进口，检测
[12]
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费用昂贵。TRFIA作为一种超微量检测技术，检测限在10-18mol/L，高于ELISA的10-10mol/L和RIA的
34(3):15-19.[5][6]
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10-12mol/L，在国内医院逐渐普及，但仍需要较为大型
的检测仪器，且不能单人份操作，不适用于基层医院。荧光微球免疫层析技术近年来发展迅速，但其荧光强度高的同时背景荧光亦高，特异性欠佳。本研究采用荧光微球时间分辨免疫层析技术，采用包裹有镧系元素（Eu）螯合物的荧光纳米微球作为标记示踪，结合了镧族元素荧光的长寿命和纳米微球的信号放大效应，荧光强度高，且荧光的发射光谱峰范围窄，检测特异性好；激发光和发射光的stokes位移大，激发光不能直接到达光电接受器，解决激发光的杂散光影响，大幅度提高了检测的灵敏度和稳定性；荧光寿命长，通过延缓测量时间，短寿命的背景荧光衰变消失后，再记录特异性的荧光，完全避免了背景荧光的干扰。
本研究建立了以血清中AFP为目的物的荧光微球时间分辨免疫层析检测方法，结合了时间分辨荧光微球高灵敏度、高特异性和免疫层析技术可进行单份标本检测、简便快速的优势[13-14]，最终检测限可达
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出实验结果；配套荧光检测仪经济、小型，更加适合基层单位；既利于大规模临床样本普查筛选和患者病情的监测，又可单人份操作。荧光微球时间分辨免疫层析作为一种灵敏、快速、经济、简便的血清AFP检测方法，具有非常好的推广应用价值。
380-383.
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（收稿日期：2015-07-02；修回日期：2015-07-22）
（编辑侯瑞）