糖醛酸的含量测定
1. 仪器、试剂与药材
Hitachi U-3010 紫外可见分光光度计（日本） 超声清洗机（Sb5200D）宁波生物科技有限公司 恒温数控水浴锅（HH—4）国华电器有限公司
半乳糖醛酸为urchem公司，咔唑为国药集团化学试剂有限公司进口分装。其他试剂均为分析纯。
0.1%的咔唑标准溶液的制备：取0.1g咔唑，精密称定，置于100ml容量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀。
半乳糖醛酸标准溶液的制备：称取20mg干燥至恒重的半乳糖醛酸对照品，精密称定，置于100ml容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，得0.1948mg/ml半乳糖标准溶液。 2.实验部分
2.1实验条件的选择：
2.1.1最大吸收波长的选择
精密吸取半乳糖醛酸标准溶液0.5ml和五加果实粗多糖溶液0.3ml，分别置于10ml的具塞刻度试管中，加水至1.00ml，加6ml浓硫酸，摇匀，沸水浴加热20分钟，冷至室温后假如0.1%的咔唑标准溶液0.25ml，摇匀。另取1.00ml水同上操作制得空白溶液。用日本hitach紫外-可见分光光度计于400-600nm波长范围内依次扫描，确定半乳醛酸最大吸收波长为520nm，样品也为520nm。
Abs0.500.450.400.350.300.250.200.150.100.050.00
糖醛酸纯品
nm
糖醛酸纯品
Peak # Start (nm) Apex (nm) End (nm) Height (Abs) Valley (nm) Valley (Abs) 600.00 520.00 419.00 0.476 50.349 419.00
半乳糖醛酸标准品
Abs1.00.90.80.70.60.50.40.3B
五加果实粗多糖样品中糖醛酸
nm
B
Peak # Start (nm) Apex (nm) End (nm) Height (Abs) Valley (nm) Valley (Abs)
1 600.00 518.00 415.50 0.953 131.559 415.50
2.1.2浓硫酸用量考察
精密吸取半乳糖醛酸标准溶液0.5ml，浓硫酸用量为3-10ml，其它操作同前，分别测定吸收度值。结果可见浓硫酸用量在6ml时溶液吸收值最大。见下表1
硫酸
加入量 （ml） 3 4 5 6 7 8 9
吸收值（A） 0.2825 0.3209 0.3601 0.3725 0.3688 0.3126 0.3068
2.1.3加酸后沸水浴时间考察
精密吸取半乳糖醛酸标准溶液0.5ml，加入浓硫酸6ml，加酸后沸水浴时间为10-40分钟。其它操作同前，分别测定吸收度值。结果可见加酸后沸水浴30分钟时溶液的吸收度最大。见表2
加热
时间 10 15 20 25 30 35 40 吸收值 0.2825 0.3022 0.3208 0.3658 0.3875 0.3528 0.3022
2.14显色剂—0.1%咔唑用量考察
精密吸取半乳糖醛酸标准溶液0.5ml加入浓硫酸6ml，加酸后沸水浴时间为30min，0.1%的咔唑用量为0.15-0.4ml，其它操作同前，分别测定吸收度值。结果可见0.1%咔唑用量为0.25ml时溶液的吸收值最大。见表3
加入量
（ml） 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 吸收值
（A） 0.2935 0.3425 0.3854 0.3654 0.3524 0.3421
2.1.5加0.1%咔唑后水浴温度的考察
精密吸取半乳糖醛酸标准溶液0.5ml，加入浓硫酸6ml，加酸后沸水浴时间为30min，加入0.1%咔唑0.25ml，加咔唑后水浴10min，温度范围40—100℃，其它操作同前，分别测定吸收度值。结果可见加0.1%咔唑后水浴温度在100℃（即沸水浴）时溶液吸收度最大。见表4
温 度
（℃） 40 50 60 70 80 90 100 吸收值
（A） 0.2845 0.3028 0.3245 0.3520 0.3689 0.3745 0.3869
2.1.6加0.1%咔唑沸水浴加热时间考察
精密吸取半乳糖标准溶液0.5ml，加入浓硫酸6ml，加酸后沸水浴时间为25min，加入0.1%咔唑0.25ml，加热时间为5—30min，其它操作同前，分别测定吸收度值。结果可见加0.1%咔唑后水浴时间在25min时溶液吸收值最大。
时 间
（min） 5 10 15 20 25 30 吸收值
（A） 0.2654 0.3804 0.3812 0.3806 0.3806 0.3801
2.1.7小结
通过上述实验，最佳操作条件应为：浓硫酸用量为6ml，加酸后沸水浴加热30min，0.1%咔唑用量为0.25ml，加0.1%咔唑后沸水浴10min，半乳糖醛酸及样品测定波长均为520nm。 2.2标准曲线的制备
精密吸取半乳糖醛酸标准溶液0.15、0.3、0.45、0.6、0.75、0.9ml分别置于10ml刻度试管中，加水至1.00ml，各加浓硫酸6ml，充分摇匀后于沸水浴中加热30min。取出后冷至室温，加0.1%咔唑0.2ml摇匀。于沸水浴中加热10min冷至室温后加浓硫酸至刻度，摇匀。另取1.00ml水同上操作制得空白溶液。在520nm波长下测定吸收值，得回归曲线方程为
A=3.67C+0.0012 R=0.9997
2.3供试品溶液的制备
精密称取精制的粗多糖0.2549g，定容到100ml的容量瓶中。 2.4稳定性试验
精密吸取供试品0.1ml，置10ml具塞刻度试管中，按标准曲线项下操作。放置不同时间间隔，分别测定吸收值。结果可见12小时内吸收度值无明显变化，表现显色稳定性良好。 时 间
（h） 0 2 4 6 8 10 12 平均值 RSD% 吸 收
值 0.3123 0.3112 0.3169 0.3104 0.3096 0.3156 0.3165 0.3132 0.97 2.5精密度实验
精密吸取同一供试品各0.5ml，置10ml具塞试管中，按标准曲线项下操作，平行测定6次。结果可见仪器精密度良好。
样 品
号 1 2 3 4 5 6 平均值 RSD% 吸 收
值 0.3096 0.3112 0.3124 0.3156 0.3175 0.3129 0.3132 0.92 2.6重复性试验
精密称取5份粗多糖各0.25mg，定容至100ml，各取溶液0.5ml，分别加入半乳糖醛酸标准溶液各0.1ml，按标准曲线项下操作，计算回收率。结果可见回收率良好。
样 品
号 1 2 4 5 6 平均值 RSD%
吸 收
值 0.3025 0.3128 0.3027 0.3155 0.3098 0.3086 1.96
2.7加样回收率
精密称取五加果实粗多糖各0.25g，精密加入半乳糖醛酸对照品8.2mg，定容至100ml。分别吸取0.1ml，按标准曲线项下操作，计算加样回收率。结果可见回收率良好 样 品 样 品 样品中 加入糖 总糖醛酸
号 量 糖醛酸 醛酸的 的量 回收率 平均值 RSD% 的 量 量
1 0.2503 8.06 8.2 16.21 99.3% 2 0.2534 8.16 8.2 16.25 98%
3 0.2498 8.01 8.2 16.22 100% 99.16 0.77 4 0.2541 8.1 8.2 16.21 98.9% 5 0.2509 8.08 8.2 16.25 99.6%
2.8，短梗五加果实粗多糖的含量测定
精密称取短梗五加果实粗多糖0.25mg，加蒸馏水定容至100ml，取供试品5份各0.1ml，按标准曲线下操作，分别测定吸收值，计算总多糖的含量。
供 试
品 1 2 3 4 5 平均值
含 量
（%） 3.21 3.05 3.25 3.09 3.07 3.14
2.9小结
糖醛酸的含量测定
1. 仪器、试剂与药材
Hitachi U-3010 紫外可见分光光度计（日本） 超声清洗机（Sb5200D）宁波生物科技有限公司 恒温数控水浴锅（HH—4）国华电器有限公司
半乳糖醛酸为urchem公司，咔唑为国药集团化学试剂有限公司进口分装。其他试剂均为分析纯。
0.1%的咔唑标准溶液的制备：取0.1g咔唑，精密称定，置于100ml容量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀。
半乳糖醛酸标准溶液的制备：称取20mg干燥至恒重的半乳糖醛酸对照品，精密称定，置于100ml容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，得0.1948mg/ml半乳糖标准溶液。 2.实验部分
2.1实验条件的选择：
2.1.1最大吸收波长的选择
精密吸取半乳糖醛酸标准溶液0.5ml和五加果实粗多糖溶液0.3ml，分别置于10ml的具塞刻度试管中，加水至1.00ml，加6ml浓硫酸，摇匀，沸水浴加热20分钟，冷至室温后假如0.1%的咔唑标准溶液0.25ml，摇匀。另取1.00ml水同上操作制得空白溶液。用日本hitach紫外-可见分光光度计于400-600nm波长范围内依次扫描，确定半乳醛酸最大吸收波长为520nm，样品也为520nm。
Abs0.500.450.400.350.300.250.200.150.100.050.00
糖醛酸纯品
nm
糖醛酸纯品
Peak # Start (nm) Apex (nm) End (nm) Height (Abs) Valley (nm) Valley (Abs) 600.00 520.00 419.00 0.476 50.349 419.00
半乳糖醛酸标准品
Abs1.00.90.80.70.60.50.40.3B
五加果实粗多糖样品中糖醛酸
nm
B
Peak # Start (nm) Apex (nm) End (nm) Height (Abs) Valley (nm) Valley (Abs)
1 600.00 518.00 415.50 0.953 131.559 415.50
2.1.2浓硫酸用量考察
精密吸取半乳糖醛酸标准溶液0.5ml，浓硫酸用量为3-10ml，其它操作同前，分别测定吸收度值。结果可见浓硫酸用量在6ml时溶液吸收值最大。见下表1
硫酸
加入量 （ml） 3 4 5 6 7 8 9
吸收值（A） 0.2825 0.3209 0.3601 0.3725 0.3688 0.3126 0.3068
2.1.3加酸后沸水浴时间考察
精密吸取半乳糖醛酸标准溶液0.5ml，加入浓硫酸6ml，加酸后沸水浴时间为10-40分钟。其它操作同前，分别测定吸收度值。结果可见加酸后沸水浴30分钟时溶液的吸收度最大。见表2
加热
时间 10 15 20 25 30 35 40 吸收值 0.2825 0.3022 0.3208 0.3658 0.3875 0.3528 0.3022
2.14显色剂—0.1%咔唑用量考察
精密吸取半乳糖醛酸标准溶液0.5ml加入浓硫酸6ml，加酸后沸水浴时间为30min，0.1%的咔唑用量为0.15-0.4ml，其它操作同前，分别测定吸收度值。结果可见0.1%咔唑用量为0.25ml时溶液的吸收值最大。见表3
加入量
（ml） 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 吸收值
（A） 0.2935 0.3425 0.3854 0.3654 0.3524 0.3421
2.1.5加0.1%咔唑后水浴温度的考察
精密吸取半乳糖醛酸标准溶液0.5ml，加入浓硫酸6ml，加酸后沸水浴时间为30min，加入0.1%咔唑0.25ml，加咔唑后水浴10min，温度范围40—100℃，其它操作同前，分别测定吸收度值。结果可见加0.1%咔唑后水浴温度在100℃（即沸水浴）时溶液吸收度最大。见表4
温 度
（℃） 40 50 60 70 80 90 100 吸收值
（A） 0.2845 0.3028 0.3245 0.3520 0.3689 0.3745 0.3869
2.1.6加0.1%咔唑沸水浴加热时间考察
精密吸取半乳糖标准溶液0.5ml，加入浓硫酸6ml，加酸后沸水浴时间为25min，加入0.1%咔唑0.25ml，加热时间为5—30min，其它操作同前，分别测定吸收度值。结果可见加0.1%咔唑后水浴时间在25min时溶液吸收值最大。
时 间
（min） 5 10 15 20 25 30 吸收值
（A） 0.2654 0.3804 0.3812 0.3806 0.3806 0.3801
2.1.7小结
通过上述实验，最佳操作条件应为：浓硫酸用量为6ml，加酸后沸水浴加热30min，0.1%咔唑用量为0.25ml，加0.1%咔唑后沸水浴10min，半乳糖醛酸及样品测定波长均为520nm。 2.2标准曲线的制备
精密吸取半乳糖醛酸标准溶液0.15、0.3、0.45、0.6、0.75、0.9ml分别置于10ml刻度试管中，加水至1.00ml，各加浓硫酸6ml，充分摇匀后于沸水浴中加热30min。取出后冷至室温，加0.1%咔唑0.2ml摇匀。于沸水浴中加热10min冷至室温后加浓硫酸至刻度，摇匀。另取1.00ml水同上操作制得空白溶液。在520nm波长下测定吸收值，得回归曲线方程为
A=3.67C+0.0012 R=0.9997
2.3供试品溶液的制备
精密称取精制的粗多糖0.2549g，定容到100ml的容量瓶中。 2.4稳定性试验
精密吸取供试品0.1ml，置10ml具塞刻度试管中，按标准曲线项下操作。放置不同时间间隔，分别测定吸收值。结果可见12小时内吸收度值无明显变化，表现显色稳定性良好。 时 间
（h） 0 2 4 6 8 10 12 平均值 RSD% 吸 收
值 0.3123 0.3112 0.3169 0.3104 0.3096 0.3156 0.3165 0.3132 0.97 2.5精密度实验
精密吸取同一供试品各0.5ml，置10ml具塞试管中，按标准曲线项下操作，平行测定6次。结果可见仪器精密度良好。
样 品
号 1 2 3 4 5 6 平均值 RSD% 吸 收
值 0.3096 0.3112 0.3124 0.3156 0.3175 0.3129 0.3132 0.92 2.6重复性试验
精密称取5份粗多糖各0.25mg，定容至100ml，各取溶液0.5ml，分别加入半乳糖醛酸标准溶液各0.1ml，按标准曲线项下操作，计算回收率。结果可见回收率良好。
样 品
号 1 2 4 5 6 平均值 RSD%
吸 收
值 0.3025 0.3128 0.3027 0.3155 0.3098 0.3086 1.96
2.7加样回收率
精密称取五加果实粗多糖各0.25g，精密加入半乳糖醛酸对照品8.2mg，定容至100ml。分别吸取0.1ml，按标准曲线项下操作，计算加样回收率。结果可见回收率良好 样 品 样 品 样品中 加入糖 总糖醛酸
号 量 糖醛酸 醛酸的 的量 回收率 平均值 RSD% 的 量 量
1 0.2503 8.06 8.2 16.21 99.3% 2 0.2534 8.16 8.2 16.25 98%
3 0.2498 8.01 8.2 16.22 100% 99.16 0.77 4 0.2541 8.1 8.2 16.21 98.9% 5 0.2509 8.08 8.2 16.25 99.6%
2.8，短梗五加果实粗多糖的含量测定
精密称取短梗五加果实粗多糖0.25mg，加蒸馏水定容至100ml，取供试品5份各0.1ml，按标准曲线下操作，分别测定吸收值，计算总多糖的含量。
供 试
品 1 2 3 4 5 平均值
含 量
（%） 3.21 3.05 3.25 3.09 3.07 3.14
2.9小结