※营养卫生
目品科学
２０１３，Ｖ０１．３４，Ｎｏ．１９
２８７
芋头多糖的分离纯化及对细胞免疫的调节作用
姜绍通，汪洪普，潘丽军
（合肥工业大学农产品Ｊｊ口７－研究院，生物与食品工程学院，安徽省农产品精深加工重点实验室，安徽合肥
２３０００９）
摘要：对自提精制芋头多糖（ＴＰＳ）进行分离纯化，研究各组分的化学特征及对小鼠体外免疫细胞功能的影响。通过水提醇沉，酶法辅助Ｓｅｖａｇ法去蛋白，透析，冷冻干燥得ＴＰＳ，经ＤＥＡＥ．５２离子交换柱雨ｑＳｅｐｈａｄｅｘＧ．７５凝胶色谱柱分离纯化得到３种多糖组分。紫外光谱扫描（ｕＶ）和高效液相色谱法（ＨＰＬＣ）鉴别多糖的纯度，气相色谱法（ＧＣ）分析单糖组成及物质的量比，小鼠体外ＭＴＴ实验测定脾淋巴细胞增殖活性，吞噬中性红实验测定巨噬细胞吞噬功能。结果表明：ＴＰＳ多糖含量为９５．２１％，分离纯化后得到ＴＰＳ∽ＴＰＳ２０１和ＴＰＳ，茈３种主要组分，ＨＰＬＣ和ｕＶ分析结果表明ＴＰＳ。。和ＴＰＳ：。。是单一纯品多糖，而ＴＰＳ瑚可能是一种糖蛋白；ＧＣ分析结果表明３种组分均是由阿拉伯糖、甘露糖、
葡萄糖和半乳糖４种单糖组成：ＭＴＴ实验表明２５、５０、１００１叫ｍＬ
ＴＰＳ２。。和ＴＰｓ，位均可提高小鼠巨噬细胞的吞噬能力。关键词：芋头；多糖；分离；纯化；细胞免疫
３种质量浓度的ＴＰｓｌｐ和１００弘ｇ，ｒｎＬ的ＴＰＳ２ｐｌ、ＴＰｓ３ｐ２均
可较强的协同ＣｏｎＡ促进小鼠脾淋巴细胞的增殖；吞噬实验结果表明２５、５０、１００岵，ｍＬ质量浓度的ＴＰＳｌ。和５０峙，ｍＬ的
Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄＩｍｍｕｎｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｙＰｒｏｐｅｒｔｙｏｆＰｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｆｒｏｍＴａｒｏ（Ｃｏｌｏｃａｓｉａｅｓｃｕｌｅｎｔａ）
ＪＩＡＮＧ
Ｓｈａｏ・ｔｏｎｇ，ＷＡＮＧ
Ｈｏｎｇ—ｐｕ，ＰＡＮＬｉ－ｊｕｎ
２３０００９，Ｃｈｉｎａ）
（ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｆｏｒＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅＰｒｏｃｅｓｓｉｎｇｏｆＡｎｈｕｉＰｒｏｖｉｎｃｅ，ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＦｏｏｄＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，
ＳｃｈｏｏｌｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
ａｎｄ
ＦｏｏｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＨｅｆｅｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｈｅｆｅｉ
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅｐｒｅｓｅｎｔｓｔｕｄｙａｉｍｅｄｔｏｉｓｏｌａｔｅａｎｄｐｕｒｉｆｙｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ（ＴＰＳ）ｆｒｏｍｔａｒｏ（Ｃｏｌｏｃａｓｉａｃｈｅｍｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｗｉｔｈｈｏｔｗａｔｅｒ
ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）．Ｔｈｅ
ａｎｄｉｍｍｕｎｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｓｕｂｊｅｃｔｅｄ
ｔｏ
ｐｒｏｐｅｒｔｙｏｆｐｕｒｉｆｉｅｄｆｒａｃｔｉｏｎｓｗｅｒｅｅｘｐｌｏｒｅｄ．ＴｈｅｃｒｕｄｅＴＰＳＷａＳｅｘｔｒａｃｔｅｄ
ａｎｄ
ｔｈｅｎ
ｐｒｏｔｅｉｎｒｅｍｏｖａｌｂｙｔｈｅｅｎｚｙｍａｔｉｃ－ａｓｓｉｓｔｅｄＳｅｖａｇ
ｍｅｔｈｏｄ．ＴＰＳ
ｏｂｔａｉｎｅｄａｆｔｅｒｄｉａｌｙｓｉｓ
ａｎｄｆｒｅｅｚｅ・－ｄｒｙｉｎｇｕｎｄｅｒｗｅｎｔｆｕｒｔｈｅｒｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｂｙＤＥＡＥ－・５２
ａｎｄ
ＳｅｐｈａｄｅｘＧ・－７５ｃｏｌｕｍｎｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙａｎｄｔｈｒｅｅ
ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄ．ＴｈｅｐｕｒｉｔｙａｎｄｃｈｅｍｉｃａｌｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｗｅｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙＵＶｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙａｎｄＨＰＬＣ
ａｎｄ
ｂｙｇａｓ
ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＧＣ），ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＴｈｅｖｉａｂｉｌｉｔｙｏｆｍｏｕｓｅｓｐｌｅｅｎｃｅｉｌｓｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈＴＰＳｆｒａｃｔｉｏｎｗａｓ
ｗｅｒｅ
ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙＭＴｒａｓｓａｙａｎｄｔｈｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓａｎａｌｙｚｅｄｂｙｎｅｕｔｒａｌ
ｒｅｄ
ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓａｓｓａｙ．
Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓ
ｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＴＰＳｃｏｎｔａｉｎｅｄ９５．２１％ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ．ＴｈｒｅｅｆｒａｃｔｉｏｎｓＴＰＳｌｐ，ＴＰＳ２ｐｌ
ａｎｄ
ＴＰＳ３ｐ２ｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄａｆｔｅｒ
ｗｅｒｅ
ｓｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．ＤａｔａｆｒｏｍＵＶｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙａｎｄＨＰＬＣａｎａｌｙｓｉｓｒｅｖｅａｌｅｄｔｈａｔＴＰＳＩｐａｎｄＴＰＳ２ｐｌ
ｔｙｐｅｓｏｆｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｗｈｉｌｅＴＰＳ３０２
ｗｅｒｅ
ｔＷＯ
ｍｉｇｈｔ
ｂｅ
ａｓ
ａ
ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ．ＡｌｌｔｈｅｔｈｒｅｅｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄｂｙＧＣａｎａｌｙｓｉｓ．ＴｈｅＭＴＴａｓｓａｙｓｓｈｏｗｅｄ
ｍａｄｅｏｆａｒａｂｉｎｏｓｅ，ｍａｎｎｏｓｅ，ｇｌｕｃｏｓｅａｎｄｇａｌａｃｔｏｓｅ
ｔｈａｔａｔｔｈｅｄｏｓｅｓｏｆ２５，５０Ｉ＿ｔｇ／ｍＬａｎｄ１００ｐｇ／ｍＬ，ＴＰＳｌｐｃｏｕｌｄｆｕｎｃｔｉｏｎｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃａｌｌｙｗｉｔｈＣｏｎＡｔｏｐｒｏｍｏｔｅｔｈｅｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆｓｐｌｅｅｎｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓｉｎｎｏｒｍａｌｍｉｃｅ，ｗｈｉｌｅｔｈｉｓｓｙｎｅｒｇｙｗａｓａｌｓｏｏｂｓｅｒｖｅｄｆｏｒＴＰＳ２。１ｏｎｌｙａｔ１００Ｉ＿ｔｇ／ｒｎＬａｎｄＴＰＳ３ｐ２ａｔ５０Ｉ＿ｔｇ／ｍＬａｎｄ１００ｃａｐａｃｉｔｙｏｆｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓｉｎ
Ｉｘｇ／ｍＬ．Ｍｅａｎｗｈｉｌｅ，ＴＰＳｌｐａｔ
ｍｉｃｅ．Ａｔ５０Ｈｇ／ｍＬ，ＴＰＳ２ｐｌａｎｄＴＰＳ３ｐ２
ｖａｒｙｉｎｇｄｏｓｅｓｃｏｕｌｄｍａｒｋｅｄｌｙｉｍｐｒｏｖｅｔｈｅｐｈａｇｏｃｙｔｏｔｉｃａｌｓｏｓｈｏｗｅｄｔｈｉｓａｃｔｉｖｉｔｙ．
ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｃｏｌｏｃａｓｌａａｎｔｉｑｕｏｒｕｍ；ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ；ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ；ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ｉｍｍｕｎｉｔｙｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ
中图分类号：Ｑ９４９．７１
ｄｏｉ：１０．７５０６／ｓｐｋｘｌ００２．６６３０－２０１３１９０５９
文献标志码：Ａ文章编号：１００２－６６３０（２０１３）１９－０２８７—０６
芋头别名为芋魁、土芝，俗称芋艿，属天南星科ｎ１。芋头中含有丰富的淀粉、膳食纤维、多糖、维生素和矿
收稿日期：２０１２—０９．１８基金项目：
物质元素，不仅可食用，还具有宽肠胃、补脾胃、腹中癖块、消痨散结等作用，主治肿毒、牛皮癣、烫火伤等
“十二五”国家科技支撑计划项目（２０ｌ１ＢＡＤ０２８０２）；安徽省科技攻关计划项目（１１０１０３０１０１２）
作者简介：姜绍通（１９５４一），男，教授，主要从事农产品生物化工研究。Ｅ—ｍａｌｌ：ｊｉａｎｇｓｈａｏｔｏｎｇ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃａ
万方数据
２８８
２０１３，Ｖ０１．３４，Ｎｏ．１９
良晶科学
※营养卫生
症口】。早期研究报道认为其主要功效与其含有花青苷、甾醇和过氧化氢酶等活性成分有关，特别是其中丰富的多糖可能具有重要作用，已有报道芋头中含有水溶性多糖，且富含杂聚糖ｐ】。多糖是自然界中储量丰富的生物聚合物，具有能量储存、结构支持、防御作用和抗原决定性等多方面的生物功能。而植物多糖具有特殊的生物活性，如协助消化、抗疲劳、抗病毒、抗菌消炎、抗衰老、抗辐射、抗肿瘤、降血糖、降血脂及免疫调节等Ｍ】。
目前国内关于芋头多糖的提取工艺和抗氧化活性具有初步的研究，有研究表明芋头中的一种中性多糖能够增强小鼠的体内免疫活性，也有报道表明芋头粗多糖具有良好的体外抗氧化性，但关于芋头多糖系统的分离纯化以及各组分的活性能力高低鲜有报道＂。８】。植物多糖的分离纯化方法多采用离子交换和凝胶柱层析相结合的方法，
而纤维素离子交换柱是一种常用的柱层析介质，本实验采用ＤＥＡＥ．５２离子纤维素交换层析柱禾］ＳｅｐｈａｄｅｘＧ一７５凝胶色谱柱层析相结合对芋头粗多糖（ＴＰＳ）进行分离纯化，并对其纯度、单糖组成和体外免疫细胞的调节功能等进行研究，比较各组分多糖对细胞免疫不同的调节能力，以期为芋头多糖的进一步研究进行探讨。
１
材料与方法
１．１
动物、材料与试剂
健康昆明种ＳＰＦ级雄性小鼠（体质量（２０＿２）ｇ，购于安
徽医科大学动物中心，合格证号为ＳＣＸＫ（皖）２０１１－００２）。
芋头购于合肥家乐福。
Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ
ＤＥＡＥ．５２纤维素、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ一７５葡聚糖凝
胶
美国Ｗｈａｔｍａｎ公司；刀豆球蛋ＥｔＡ（ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎＡ，
ＣｏｎＡ）、噻唑蓝（ＭＴＴ）美国Ｓｉｇｍａ公司；ＲＰＭＩ－１６４０完全培养液、台盼蓝染液
北京索莱宝科技有限公司；苯
酚、浓硫酸、无水乙醇、９５％乙醇、无水乙醚、丙酮、三氯甲烷、正丁醇、葡萄糖（均为分析纯）
国药集团化
学试剂有限公司。
１．２
仪器与设备
ＮＪＬ０７．３型实验用微波炉
南京杰全仪器有限
公司；Ｒ．２０１旋转蒸发器
上海申胜生物技术有限公
司；ＱＰ２０１０气相色谱．质谱联用仪
日本岛津公司；ＵＶ７５７ＣＲＴ紫外．可见分光光度计
上海成光仪器有限公司：Ａｇｉｌｅｎｔ
１
１００凝胶色谱仪美匡ＩＡｇｉｌｅｎｔ公司；Ｂｉｏ．
Ｒａｄ
Ｍｏｄｅｌ
６８０
ＣＯ，培养箱
美国Ｂｉｏ．Ｒａｄ仪器公司；ＨＣ．
３０１８Ｒ型高速冷冻离心机安徽中科中佳科学仪器有限
公司；ＢＳ一１００Ａ—ＬＣＤ自动部分收集器
上海琪特分析仪
器有限公司：ＭＣＯ．１７ＡＩＣ酶标仪
赛默飞世尔仪器公
司；超净工作台
上海新竹机电设备有限公司。
万方数据
１．３方法
１．３．１
芋头精制多糖（ＴＰＳ）的提取
新鲜芋头一清洗、去皮、切块一烘干质量至恒定一
粉碎过４０目筛一芋头干粉１００９－－＊Ｊ３［１Ａ．３０００ｍＬ蒸馏水微波预处理（４００Ｗ，８０ｓ）－－－８０。Ｃ水浴提取３ｈ一滤渣二次提取一合并滤液后浓缩一酶解去淀粉（先按照２０Ｕ／ｇ｝Ｊｌｌ入液化酶，７５℃，ｐＨ６．０酶解１。５ｈ，再按照２００ｕ／ｇ加入糖化酶，６０。Ｃ，ｐＨ６．５酶解１．５ｈ）一醇沉过夜一抽滤并用无水乙醇、无水乙醚、无水丙酮各淋洗２次一沉淀复溶一酶解脱蛋白（中性蛋白酶，ｐＨ６，６ｈ）－－＊Ｓｅｖａｇ法脱蛋白１３次一Ｈ２０２脱色素一流水透析３６ｈ（分子质量３５００Ｄ）一蒸馏水透析３６ｈ一浓缩后冷冻干燥一精制芋头多糖ＴＰＳ
１．３．２
ＴＰＳ含量的测定采用苯酚．硫酸法一］。
１．３．３
ＴＰＳ的ＤＥＡＥ．５２离子交换层析柱层析ｎ川
ＤＥＡＥ．５２阴离子交换柱（Ｃｌ～型）装柱（柱型：
１．６ｃｍ×８０ｃｍ），先用蒸馏水平衡２４ｈ，准确称取ｌｇ
ＴＰＳ
溶于最小体积的双蒸水中，６０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ后取上清液上柱。依次用双蒸水以及０．１～０．５ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＣＩ溶液、以２．０ｍＬ／ｍｉｎ的速率梯度洗脱，用自动部分收集器收集，以苯酚一硫酸法对ＴＰＳ的洗脱情况进行跟踪测试，检测多糖的含量。以试管的管号为横坐标，吸光度为纵坐标绘制洗脱曲线图。根据测定的结果合并多糖溶液，真空浓缩后对蒸馏水透析３６ｈ，冷冻干燥。主要组分中
包括一个中性多糖组分ＴＰＳ。（０．５７２９）和两个酸性多糖组分
１．３。４
ＴＰＳ主要组分的ＳｅｐｈａｄｅｘＧ一７５凝胶柱层析“”ＳｅｐｈａｄｅｘＧ一７５凝胶柱（柱型：１．６ｃｍ×６０ｃｍ）装柱后
用０．０２ｍｏＬ／Ｌ的ＮａＣＩ溶液平衡２４ｈ。上述３个组分ＴＰＳ．、Ｇ．７５凝胶柱，称取０．２９多ＮａＣｌ溶液中，上样
后用０．０２ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ来洗脱，洗脱速率为０．２ｍＬ／ｍｉｎ，用
自动部分收集器收集，每管收集２ｍＬ，苯酚．硫酸法跟踪检测糖含量，以管号为横坐标，吸光度为纵坐标绘制洗
脱曲线图，收集合并主多糖峰，透析脱盐、冷冻干燥。
得Ｎ３个主要的多糖组分ＴＰＳ。。（０．１６５９）、ＴＰＳ２ｐｌ（０．１０７９）和
１９９）。
１．３．５
ＴＰＳ中３个多糖组分的纯度鉴定
紫外光谱扫描Ｈ２１：将ＴＰＳｌｐ、ＴＰＳ２ｐｌ和ＴＰＳ３ｐ２配制成
ｌｍｇ／ｍＬ的溶液，以蒸馏水作为空白对照，紫外分光光度计在２００～４００ｎｍ范围内进行全波长扫描。
高效液相色谱法（ＨＰＬＣ）进行进一步的纯度鉴定，首先将样品配制成１０ｍｇ／ｍＬ的多糖溶液，过０．４５９Ｌ滤膜后
色谱条件：Ａｇｉｌｅｎｔｌ１００高效液相色谱系统，色谱
柱：ＴＳＫＧ３０００ＰＷ色谱柱，流动相：０．１ｍｏＬ／ＬＮａＣｌ，
ＴＰＳ２（０．１６５９）、ＴＰＳ３（０．１８７９）。
ＴＰＳ，和ＴＰＳ，分别再过Ｓｅｐｈａｄｅｘ糖组分小心溶于最小体积的０．０２ｍｏＶＬＴＰＳ３ｐ２（０．１进行ＨＰＬＣ分析“３１。
※营养卫生
匡墨蘧
ＴＰＳ
２０１３，Ｖ０１３４．Ｎｏ．１９
２８９
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ，柱温：３０℃，示差折光检测器温
度：３０℃。
１．３．６
１．３．６．１
贴壁的巨噬细胞中加入不同质量浓度的＇ｒＰＳ”ＴＰＳ，小
３ＰＪ和香菇多糖的ＲＰＭＩ一１６４０培养液（含血清）１００９Ｌ，
ＴＰＳ中３个组分的单糖组成分析多糖水解及糖腈乙酸酯衍生化”４。１５１
使多糖终质量浓度分别为２５、５０、１００９９／ｍＬ，同时设空白对照组（不含多糖的培养液１００ｐＬ），每组设６个复孔。将培养板置于饱和湿度，３７℃、５％ＣＯ，培养箱中培养２４ｈ后，弃去上清液，用３７℃的ＰＢＳ洗２次后加入０．０７２％中性红
ｌｏｏｒｔｕ孔，培养３０ｍｉｎ后弃去中性红，用ＰＢＳ洗３次，加入细
多糖的水解：分别取５ｍｇ多糖样品，溶解于４ｍＬ
２ｍｏｌ／Ｌ的ＴＦＡ中后封管，１２０℃水解４ｈ，浓缩至干再加入３ｍＬ甲醇继续蒸干，重复４４５次除尽残留的ＴＦＡ。将样品溶解于３ｍＬ蒸馏水中，ＤＩ］３０ｍｇＮａＢＨ。室温还原３ｈ，用２５％乙酸中和过量ＮａＢＨ。至溶液不再产生气泡，最后ＤＮ３ｍＬ甲醇继续蒸干４～５次除去副产物硼酸及水分。于
胞裂解液（坎０．１ｍｏＬ／Ｌ冰乙酸）：坎无水乙醇）＝１：１）２００ｒｔＬ／孔，４。Ｃ过夜，用酶标仪于波长５４０ｎｍ处测吸光度。吞噬能力以实验组吸光度与空白对照组吸光度的比值表示。
２
１２０℃烘箱中１５ｍｉｎ以充分除去水分，得到各样品的单糖
混合物，备用。
结果与分析
糖腈乙酰酯衍生物的制备：取上述的单糖混合物加
入３ｍＬ乙酸酐和３ｍＬＩＩＬＬ啶，密塞，１００℃反应ｌｈ，减压浓缩加３ｍＬ三氯甲烷溶解后用水萃取洗涤多次，最后用无
３
２．１
芋头多糖ＤＥＡＥ一５２离子交换柱层析结果
水ＮａＳＯ。去除残留水分，离心取上清液进行Ｇｃ分析。各标准品单糖无需水解处理，糖腈乙酰酯衍生物采用按上述方法制备。６种标准单糖分别为鼠李糖（Ｒｈａ）、阿拉伯糖（Ａｒａ）、木糖（Ｘｙｌ）、甘露糖（Ｍａｎ）、葡萄糖（Ｇｌｕ）、半乳
糖（Ｇａｌ）。
１．３．６．２
ｉ飞
２２
；１
１０Ｏ
气相色谱（ＧＣ）检测条件”６】
ｏ
２５５０７５１００１２５１５０
色谱柱：ＨＰ一５ｍＳ石英毛细柱（３０ｍ×０．３２ｍｍ，０．２５ｐｍ）；程序升温：色谱柱初温１５０℃，保留ｌｒａｉｎ，以１０℃／ｍｉｎ升温至２００℃，再以４℃／ｍｉｎ的升温速率升温
Ｆｉｇ．１
管号
图１
Ｅｌｕｔｉｏｎ
ＴＰＳ
ｅｌｌｒｖｅ
ＤＥＡＥ・５２离子交换柱洗脱曲线
ｏｎ
ｏｆＴＰＳ
ＤＥＡＥ・５２ａｎｉｏｎｅｘｃｈａｎｇｅｃｏｌｕｍｎ
至Ｕ２７０℃，保留ｌｍｉｎ；气化室温度：２８０℃；检测器温度３００℃；载气Ｈｅ流速２５ｍＬ／ｍｉｎ；Ｈ，流速４０ｍＬ／ｍｉｎ：空气
流速４００ｍＬ／ｍｉｎ；分流比１０：１；柱流速１．５ｍＬ／ｍｉｎ。
１．３．７
由图１可知，ＴＰＳ经过双蒸水和０Ｉｌｔ～０．５ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＣＩ
溶液梯度洗脱后分离得Ｎ６个洗脱峰，其中双蒸水洗脱组分的有一个最强的吸收峰，说明芋头多糖中主要为中性多糖。同时ＴＰＳ中还含有一部分的酸性多糖。由于
０．３～０．５ｍｏｌ／Ｌ
正常小鼠体外免疫细胞增值ＭＴＴ实验”７ｌ
取健康昆明种ＳＰＦ级雄性小鼠３只，按文献『１７］方法制得细胞浓度为３×１０６个／ｍＬ的脾单细胞悬液。９６孔板
中每孔加入细胞悬液１００９Ｌ，空白对照组每孔加入１００ｔａＬ
ＮａＣＩ溶液洗脱峰较小，考虑到后续葡聚糖
凝胶柱层析的可操作性，选取中性多糖组分ＴＰＳ．（２～１８管）和０．１、０．２ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ溶液分别洗脱的酸性多糖组分
含有ＣｏｎＡ和１０％标准胎牛血清的ＲＰＭＩ．１６４０完全培养液（ＣｏｎＡ的终质量浓度为５Ｉ＿ｔｇ／ｍＬ），实验组分别加入１００９Ｌ不同质量浓度的ＴＰＳｌｐ
ＴＭ
ＴＰＳ２（３０～４８管）；ｆＵＴＰＳ，（５６～７４管）作进一步的分离纯化。
收集这３个组分，透析脱盐后冷冻干燥，得蛰ＪＴＰＳ．、ＴＰＳ２、ＴＰＳ３３种白色的多糖粉末，其含量分别为５７．２０％、１６．５ｌ％和１８．７２％。
２．２
ＴＰＳ：。：、ＴＰＳ川、香菇多糖的
ＲＰＭＩ．１６４０完全培养液（含ＣｏｎＡ和血清），使得多糖的终质量浓度分别为２５、５０、１００９９／ｍＬ，每组设６个复孔在
饱和湿度、５％ＣＯ，、３７℃的培养箱中培养６８ｈ后，每孔加入５ｍｇ／ｍＬＭＴＴ５０９Ｌ，继续培养４ｈ后每孔再加入ｌｍＬ酸性异丙醇，混匀，使紫色结晶完全溶解。用酶标仪于５７０ｎｍ波长处测定吸光度。结果以彳啪。。值表示小鼠脾细胞能量代谢水平的高低。
１．３．８
ｚＰＳ中３个组分的ＳｅｐｈａｄｅｘＧ一７５凝胶柱层析结果
０ｏｌ
ｏ
晕
弋ｏ
０
小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红实验”８】按照文献【１８】的方法得到细胞数为１．５
Ｘ
１０６个／ｍＬ的
０
０
５
１０
１５
２０
２５
３０
３５
混悬细胞液。每孔１００Ｉ．ｔＬＮ入Ｎ９６孑Ｌ板中，放入３７℃、
管号
图２
Ｆｉｇ．２
５％ＣＯ：培养箱培养２ｈ，弃去上清液，再用３７。Ｃ的ＰＢＳ洗
去未贴壁的细胞，贴壁的细胞即为巨噬细胞。于每孔
ＴＰＳ。的ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－７５凝胶柱洗脱曲线
Ｏｎ
ＥｌｕｌｉａｎＣｌｌｌｗｅｏｆＴＰＳｌＳｅｐｈａｄｅｘ１７，－７５ａｎｉｏｎｅｘｃｈａｎｇｅ
ｃｏｌｕｍｎ
万方数据
２９０
２０１３，～ｒ０１．３４．Ｎｏ．１９
匡匿磕
※营养卫生
Ｏ．５０．４ｌ０．３飞
莩
０．２０．１Ｏ．０
０
５
１０
１５
２０
２５
３０３５４０４５
５０
５５
６０６５
管号
图３
ＴＰＳ２的ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－７５凝胶柱洗脱曲线
Ｆｉｇ．３
ＥｌｕｔｉｏｎＯｌｉＶｅｏｆＴＰＳ２０ｎＳｅｐｈａｄｅｘＧ－７５ａｎｉｏｎｅｘｃｈａｎｇｅｃｏｌｕｍｎ
０．５
０．４§０．３
莩
弋Ｏ．２
０．１
０．０
Ｏ
５
１０１５２０２５３０３５４０４５５０５５６０６５７０７５８０
管号
图４
ＴＰＳ３的ＳｅｐｈａｄｅｘＧ一７５凝胶柱洗脱曲线
Ｆｉｇ．４
ＥｌｕｌｉｏｎｃｕｒｖｅｏｆＴＰＳ３０ｎＳｅｐｈａｄｅｘＧ－７５ａｎｉｏｎｅｘｃｈａｎｇｅｃｏｌｕｎｍ
由图２可知，中性多糖ＴＰＳ．经过ＳｅｐｈａｄｅｘＧ．７５凝胶柱层析柱分离后得到一个单一的洗脱峰，说明ＴＰＳ．是单一
的多糖组分，收集７～２６管洗脱液，透析脱盐后冷冻干燥得到白色粉末状的中性多糖ＴＰＳ＂由图３可知，酸性多糖ＴＰＳ２经过凝胶柱层析分离后得至ＩＪＴＰＳ２ｐｌＳｔｌＴＰＳ２ｐ２两种组分，由于ＴＰＳ２０２较ＴＰＳ２ｐｌ含量较少，不便于后续的研究，收集主要组分ＴＰＳ捌（６～３２管）进行进一步的分析研究。
由图４可知，ＴＰＳ榴！过ＳｅｐｈａｄｅｘＧ一７５凝胶柱层析柱分离
后也得到两种组分ＴＰＳ３ｐｌ乘］ＴＰＳ３。２。而ＴＰｓ３ｐ２的含量远高ｊ：ＴＰＳ３ｐｌ的含量，为便于研究收集ＴＰＳ３ｐ２（３５～６１管）洗脱峰，对水透析脱盐后冷冻干燥。ＴＰＳ”ＴＰＳ２ｐｌ和ＴＰＳ３ｐ２的
含量分别为８２．５０％、６８．６３％、７１．５４％。
２．３
ＴＰＳ。。、ＴＰＳ２ｐｌ和ＴＰＳ３ｐ２的紫外光谱扫描和ＨＰＬＣ色
谱结果
由图５～７可知，ＴＰＳ．。、ＴＰＳ：。。和ＴＰＳ３Ｄ２分别进行
ＨＰＬＣ色谱分析，通过示差检测器检测，均呈现单一对称的尖峰，而这３个组分均是先经过阴离子树脂交换和分子排阻柱色谱分离后获得，故可认为ＴＰＳｌｐ、ＴＰＳ２ｐｌ和ＴＰＳ３Ｐ２为３种单一的多糖组分。在紫外光谱图中，可以看，Ｗ，ＴＰＳ。。和ＴＰＳ圳在波长２００ｎｍ左右有多糖的特征吸收峰，而在波长２６０ｎｍ和２８０ｎｍ处无明显特征吸收峰，说［珥ＴＰＳｌ。和ＴＰＳ：。，不含蛋白质、氨基酸和核酸，也不含酚类成分”９１，由图７可知，ＴＰＳ瑚除了有多糖的特征吸收峰以外，在波
长２８０ｎｍ处还有微弱的吸收峰，其中可能含有少量的蛋白质，而ＨＰＬＣ色谱显示ＴＰＳ３。２是单一纯品，故其可能是
一种含有少量的蛋白质的多糖蛋白复合物。
万方数据
１．４１．２１．０弋０．８
０．６０．４０．２
Ｏ．Ｏ
２００２２０２４０２６０２８０３００３２０３４０３６０３８０４００
波长／ｒｉｍ
１０８
＞６
暑４
２
０
２
４
６
８
ｌＯ
１２
１４
１６
１８
２０
时间／ｍｉｎ
图５ＴＰＳＩ。的紫外光谱扫描图和ＨＰＬＣ色谱图
Ｆｉｇ．５
ＵＶｓｐｅｃｔｒｕｍａｎｄＨＰＬＣｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｏｆＴＰＳＩｐ
２００２２０２４０２６０２８０３００３２０３４０３６０３８０４００
波长／ｒｉｍ
３．０２．５２．０＞１．５ｇ１．０
０．５０．０一Ｏ．５
２
４
６
８
ｌＯ
１２
１４
１６
１８
时间／ｍｉｎ
图６
ＴＰＳ２ｐｌ的紫外光谱扫描图和ＨＰＬＣ色谱图
Ｆｉｇ．６
ＵＶｓｐｅｃｔｒｕｍａｎｄＨＰＬＣｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｏｆＴＰＳ２ｐｌ
１．６１．４１．２１．０飞０．８
０．６０．４０．２
００
２００２２０２４０２６０２８０３００３２０３４０３６０３８０４００
波长／ｎｍ
※营养卫生
食品科学
２０１３，ＶｏＺ３４，Ｎｏ．１９
２９１
３．５３．０２．５２．０＞１．５ｇ
１０
０．５０．０—０．５
２
４
６
８
ｌＯ
１２
１４
１６
１８
时间／ｍｉｎ
图７
ＴＰＳⅫ的紫外光谱扫描图和ＨＰＬＣ色谱图
Ｆｉｇ．７
ＵＶ
ｓｐｅｃｔｍｍａｎｄＨＰＬＣｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｏｆＴＰＳ３ｐ２
２．４
ＴＰＳ”ＴＰＳ２。ｌ和ＴＰＳ３Ｄ２单糖组成分析
图８～１ｌ是混合标准品和ＴＰＳ”ＴＰＳ：。。和ＴＰＳ３Ｄ２的乙
酰衍生物的ＧＣ图谱，根据各单糖标准品的乙酰化衍生物的ＧＣ图谱，确定混合标准品在ＧＣ中的出峰顺序２～７分别为鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖，其中ｌ号峰是溶剂峰，未在图中标示。
９７８
ｆ
６
宝５
×４
善ｉ
１０—１
时间／ｍｉｎ
图８
标准单糖乙酰化衍生物ＧＣ图谱
Ｆｉｇ．８
ＧＣ
ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｏｆｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｔａｎｄａｒｃｂ
ｐ
ｏ一
×
＞
２３．
７８９１０
ｌｌ
１２１３１４１５１６
时间／ｒａｉｎ
图９
ＴＰＳｌ。乙酰化衍生物ＧＣ图谱Ｆｉｇ・９
ＧＣ
ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｏｆＴＰＳＩｐａｌｄｉｔｏｌａｃｅｔａｔｅ
１．７５１．５０
一１．２５
呈１００
己ｏ．７５薹０．５０
０．２５０．ＯＯ
７
８
９
１０
１１
１２
１３
１４
１５
１６
时间／ｍｉｎ
图ｌＯ
ＴＰＳｈｌ乙酰化衍生物ＧＣ图谱
Ｆｉｇ・１０
ＧＣ
ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｏｆＴＰＳ２ｐＩａｌｄｉｔｏｌａｃｅｔａｔｅ
万方数据
ｒ
ｏ一
×
一＞
ｉ
６７８９１０】１１２１３１４１５
１６１７
时间／ｍｉｎ
图１１
ＴＰＳⅥ乙酰化衍生物ＧＣ图谱
Ｆｉｇ．１１
ＧＣｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｏｆｏｆＴＰＳ３ｐ２
ａｌｄｉｔｏｌａｃｅｔａｔｅ
混合标准单糖的保留时间和峰面积见表ｌ，３种多糖
组分的保留时间和峰面积及各组分单糖种类和物质的量比结果见表２，ｎ－－Ｊ失［１ＴＰＳ”ＴＰＳ川币ＵＴＰＳ碰的单糖中均含有阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，ＴＰＳ。。中这４种单糖的物质的量比分别为２，７６：２．１２：７．６１：３．３０；ＴＰＳ２。。，ｐ４种单糖物质的量比为２．４４：４．０７：１．８７：１２．１０；ＴＰＳⅫ中４种单糖的物质的量比为１．２７：１．８９：１．１３：５．９７。而ＴＰｓ２。ｌ干ＨＴＰＳ瑚
中均有保留时间为１０．２４３ｍｉｎ的色谱峰，这可能是‘种未知单糖，尚待进一步研究。
表ｌ
标准单糖乙酰化衍生物的ＧＣ数据表
Ｔａｂｌｅｌ
ＧＣＤａｔａｏｆａｉｄｉｔｏｌａｃｅｔａｔｅｓｏｆｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｔａｎｄａｒｄｓ
标准单糖鼠李糖
阿拉伯糖
木糖
甘露糖
葡萄辖
、卜乳赣
保留时ｆｎｑ／ｍｉｎ８．９５３９．１３７９．４００１２，７３２１２．８９８１３．０４５峰向积
３３７５１１８
２９５４６３８
４９９１２８３
２４６５７７．８
２９０１７００
４１９５４６７
表２
ＴＰｓ。，、ＴＰＳ２ｐｌ和ＴＰＳ聊的单糖组分及单糖组成物质的量比
Ｔａｂｌｅ２
ＭｏｎｏｓａｃｅｈａｒｉｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｏｆＴＰＳｌｐ，ＴＰＳ２ｐＩａｎｄＴＰＳ３ｐ２
多糖组分保留时间／ｍｉｎ
峰而积
单糖组成
物质的擐比；
９１３０８１５１４．８…阿拉伯糖２．７６……
１２．７５８５２２５２．０”露糖
２１２１２．９３２２２０８２０．２葡萄糖
７．６ｌ１３．０７９１３８６３０．０半乳糖
３３０９．１２９７２１０９．８阿拉伯糖２．４４
１０．２４３１０２２３５２１２．７５６１００４１７．４甘露糖
４．０７１２．９２９５４１７６３葡萄糖
Ｉ８７１３．０８２５０７６６０．１半乳糖１２．１９．１３３
３７５３２．５阿拉们糖１．２７
１０．２４３７４０００５１２．７５８４６５０２．７甘露糖１．８９１２．９２８３２８２８．１葡萄糖１．１３１３．０８４
２５０６１９４
半乳糖
５．９７
注：・．多糖中各单糖的峰面积与标准单糖的峰面积的比值（实验时标准单糖质量和多糖样品质量相等）。
２．５
ＴＰＳ”ＴＰＳ２ｐｌ和ＴＰＳ３ｐ２小鼠体外脾细胞增殖ＭＴＴ实
验结果
淋巴细胞增殖实验是检测机体细胞免疫功能的‘种
体外实验，淋巴细胞在体外培养时，当受到非特异性刺
激物有丝分裂刺激后，可转化为淋巴母细胞从而使淋巴
细胞增殖。而ＣｏｎＡ是小鼠Ｔ细胞特异性丝裂原，测定多
糖协同ＣｏｎＡ促进小鼠淋巴细胞增殖的强弱，能反映多糖
对Ｔ淋巴细胞增殖功能的影响【２０１。３种多糖组分对ＣｏｎＡ促进的小鼠脾细胞增殖能力的影响结果见表３。
２９２
２０１３，Ｖ０１．３４，Ｎｏ．１９
食品科学
※营养卫生
表３
ＴＰＳ帕ＴＰＳ２Ｐ１和ＴＰｓ，ｐ２对ＣｏｎＡ诱导的小鼠脾细胞增殖
能力的影响伽－－６）
Ｔａｂｌｅ３Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆ
ＴＰＳｌｐ，ＴＰｓ却Ｉ
ａｎｄ
１１ＰＳ却２
ｏｎ
ｔｈｅＣｏｎＡ・ｉｎｄｕｃｅｄ
ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆ
ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ／ｎｖｉｔｒｏ加－－６）
组别ＴＰＳｌ。ＴＰＳ。．ＴＰＳｍ
香菇多糖
空白对照组０．４４６＋＿０．０７ｌ
０．４４６＿＋０．０７１
０．４４６＋０．０７ｌ０Ａ４６＿＋００７１刑量，
２５０．６１２－＋０．０６２＋０．４２６－＋０．０６３０．４８３－＋０．０５３
０．６２７±０．０５５＊
ｒｐｇ／ｍＬ）
５００．７９６±０．０８ｌ”０．４８７＋＿０．０７８
０．５９４±０．０６５＋Ｏ．８４９＋０．０９４＋＋
１００
０．８１６±０．０５９＊＊０．５６３－＋０．０４ｌ‘０．５８７±Ｏ，０８２‘
Ｏ，８０８－＋０．０６ｌ＋｝
注：＋．与空白对照组相比，有显著性差异（Ｐ＜Ｏ．０５）；＋＋．与空白对照组相比，有极显著性差异（Ｐ＜０．０１）。下同。
由表３可知，与空白对照组相比，３种质量浓度的ＴＰＳ，。和香菇多糖均可协同ＣｏｎＡ促进小鼠脾淋巴细胞的增殖，且高、中质量浓度的ＴＰｓ。。的协同能力更强（Ｐ＜０．０１）；只有高质量浓度的ＴＰｓ：。，对ＣｏｎＡ表现出较高的协同能力（Ｐ＜０．０５），而中、低质量浓度的ＴＰｓ：。。的协同能力并不明显，可能是因为质量浓度太低ＴＰＳ：。。对其作用不明显；高、中质量浓度的ＴＰｓ抛多糖协同ＣｏｎＡ能显著的提高小鼠脾细胞的增殖能力ｐ＜０．０５）。综上得出中性多糖ＴＰＳ。。可以很好的协同ＣｏｎＡ促进小鼠的脾淋巴细胞的增殖，促进Ｔ细胞的成熟分化，且其协同能力略低于香菇多糖。
２．６
ＴＰＳ＂ＴＰＳ，。，和ＴＰＳ瑚对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红实验结果
巨噬细胞是机体非特异性免疫系统的重要组成部
分，也是机体免疫监视功能的重要效应细胞，具有免疫监视、免疫防御和抗原呈递等免疫功能，对机体维持内部健康的环境起着至关重要的作用。而单核巨噬细胞的吞噬能力是衡量机体非特异性免疫功能的标志之一口”。３种多糖组分对小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力的影响结果见表４。
表４
ＴＰＳｌｐ、ＴＰＳ２Ｐｔ和ＴＰｓ３，２ｘ，／ｄ、鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力的影响铆硼
Ｔａｂｌｅ４
Ｅｆｆｅｃｔｓ
ｏｆＴＰＳｌｐ，ＴＰＳ砷ｔａｎｄ
ＴＰｓｋＯｎ
ｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ
ｉｎｄｅｘ（ｎ＝６）
Ｂｌ量／（ｐ．ｇ／ｍＬ）伸ｓ１２
ＴＰＳ圳ＴＰＳ塑
香菇多糖
２５１．１０９－＋０．１３４＊０．９７６－＋０．０９８
１．００５－＋０．０８８
０．９８９－＋０．１０７５０１．１８５－＋０．１４８＂＊１．１６５－＋０．０８９＊Ｉ．１４７±ａ１６８‘
１．１４１±ｏ．１５３’‘１００
１．１８２－＋０．１２４・＋
１．０４ｌ－＋０．１０３
１．１１９＋＿０．１４３’
１．１３９－＋０１４４＋＋
由表４可知，３种质量浓度ｆ簪ＪＴＰＳｌｐ均可显著提高小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力妒＜０。０５），中质量浓度ＩＥｌＴＰＳｚｐ，和高、中质量浓度的ＴＰＳ，讲香菇多糖能显著提高小鼠巨噬细胞的吞噬能力沪＜０．０５）。３种多糖组分对巨噬细胞吞噬能力的影响没有明显的剂量．效应关系，且可以看出ＴＰＳＩｐ表现出最高的活性能力，其余两种多糖组分也表现出一定的
活性能力。
３
结论
本实验以芋头为实验材料提取精制芋头多糖ＴＰＳ，通过ＤＥＡＥ．５２离子交换柱层和ＳｅｐｈａｄｅｘＧ一７５凝胶柱层析的分离纯化，｛！导至！ＪＴＰＳ】ｐ、ＴＰＳｌｐ、ＴＰＳ２ｐ２、ＴＰＳ３Ｐｌ和ＩＴＰＳ３ｐ２组分，对其中的３种主要组分ＴＰｓｌ。、ＴＰＳ２。－．；｝Ｉ］ＴＰＳ３ｐ２进行
万方数据
进一步研究，紫外扫描光谱和高效液相色谱分析结果表明这３种组分的均一度良好，ＴＰＳ，。和ＴＰＳ：。。是单一的多糖组分而ＴＰｓ瑚可能是一种多糖蛋白的复合物。单糖组成分析结果表Ｂ．，目ＴＰＳ∽ＴＰＳ：。。和ＴＰＳ３ｐ２中均由阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成，ＴＰＳ，。中这４种单糖的物质的量比分别为２．７６：２．１２：７．６１：３．３０；ＴＰＳ２。。中４种单糖物质的量比为２．４４：４．０７：１。８７：１２．１０；ＴＰＳ３Ｄ２中４种单糖的物质的量比为１．２７：１．８９：１．１３：５．９７。小鼠体外免疫实验结果
表明２５、５０、１００｝ｌ∥ｍＬ３种质量浓度＠ＴＰＳｌＤ’高质量浓
度ＴＰＳ２Ｄ】和高、中质量浓度的ＴＰｓ３ｐ２均可协同ＣｏｎＡ显著促进小鼠脾淋巴细胞的增殖能力；３种质量浓度ＴＰＳ＂中质量浓度的ＴＰｓ：。，和高、中质量浓度酐ＪＴＰＳｍ均可显著提高小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力。结果表明：ＴＰＳ”ＴＰＳ：。，和ＴＰＳ瑚对正常小鼠的细胞免疫功能均有一定的调节作用，而且ＴＰＳ，。较另外两种多糖表现出较高的活性能
力，在细胞免疫调节方面略低于香菇多糖，具有进一步
进行小鼠体内免疫实验的研究价值。
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『２０１
ＭＡＴＳＵＭＯＴＯＴ，ｌｅｄＹＯＨＡＲＡＨ，ＹＡＭＡＤＡＨ，ｅｔａ１．Ｔｈｅｐｅｃｔｉｃ
ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｆｒｏｍＢｕｐｌｅｕｒｕｍｆａＩｃａｔｕｍＬ．ｅｎｈａｎｃｅｓｃｌｅａｒａｎｃｅｏｆｉｍｍｕｎｅｃｏｍｐｌｅｘｅｓｉｎｍｉｃｅ｛Ｊ］．ＰｈｙｔｏｔｈｅｒＲｅｓ，１９９６，ｌＯ（７）：５８５—５８８．
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芋头多糖的分离纯化及对细胞免疫的调节作用
作者：作者单位：刊名：英文刊名：年，卷(期)：
姜绍通， 汪洪普， 潘丽军， JIANG Shao-tong， WANG Hong-pu， PAN Li-jun
合肥工业大学农产品加工研究院,生物与食品工程学院,安徽省农产品精深加工重点实验室,安徽合肥230009食品科学Food Science2013,34(19)
本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_spkx201319059.aspx
※营养卫生
目品科学
２０１３，Ｖ０１．３４，Ｎｏ．１９
２８７
芋头多糖的分离纯化及对细胞免疫的调节作用
姜绍通，汪洪普，潘丽军
（合肥工业大学农产品Ｊｊ口７－研究院，生物与食品工程学院，安徽省农产品精深加工重点实验室，安徽合肥
２３０００９）
摘要：对自提精制芋头多糖（ＴＰＳ）进行分离纯化，研究各组分的化学特征及对小鼠体外免疫细胞功能的影响。通过水提醇沉，酶法辅助Ｓｅｖａｇ法去蛋白，透析，冷冻干燥得ＴＰＳ，经ＤＥＡＥ．５２离子交换柱雨ｑＳｅｐｈａｄｅｘＧ．７５凝胶色谱柱分离纯化得到３种多糖组分。紫外光谱扫描（ｕＶ）和高效液相色谱法（ＨＰＬＣ）鉴别多糖的纯度，气相色谱法（ＧＣ）分析单糖组成及物质的量比，小鼠体外ＭＴＴ实验测定脾淋巴细胞增殖活性，吞噬中性红实验测定巨噬细胞吞噬功能。结果表明：ＴＰＳ多糖含量为９５．２１％，分离纯化后得到ＴＰＳ∽ＴＰＳ２０１和ＴＰＳ，茈３种主要组分，ＨＰＬＣ和ｕＶ分析结果表明ＴＰＳ。。和ＴＰＳ：。。是单一纯品多糖，而ＴＰＳ瑚可能是一种糖蛋白；ＧＣ分析结果表明３种组分均是由阿拉伯糖、甘露糖、
葡萄糖和半乳糖４种单糖组成：ＭＴＴ实验表明２５、５０、１００１叫ｍＬ
ＴＰＳ２。。和ＴＰｓ，位均可提高小鼠巨噬细胞的吞噬能力。关键词：芋头；多糖；分离；纯化；细胞免疫
３种质量浓度的ＴＰｓｌｐ和１００弘ｇ，ｒｎＬ的ＴＰＳ２ｐｌ、ＴＰｓ３ｐ２均
可较强的协同ＣｏｎＡ促进小鼠脾淋巴细胞的增殖；吞噬实验结果表明２５、５０、１００岵，ｍＬ质量浓度的ＴＰＳｌ。和５０峙，ｍＬ的
Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄＩｍｍｕｎｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｙＰｒｏｐｅｒｔｙｏｆＰｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｆｒｏｍＴａｒｏ（Ｃｏｌｏｃａｓｉａｅｓｃｕｌｅｎｔａ）
ＪＩＡＮＧ
Ｓｈａｏ・ｔｏｎｇ，ＷＡＮＧ
Ｈｏｎｇ—ｐｕ，ＰＡＮＬｉ－ｊｕｎ
２３０００９，Ｃｈｉｎａ）
（ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｆｏｒＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅＰｒｏｃｅｓｓｉｎｇｏｆＡｎｈｕｉＰｒｏｖｉｎｃｅ，ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＦｏｏｄＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，
ＳｃｈｏｏｌｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
ａｎｄ
ＦｏｏｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＨｅｆｅｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｈｅｆｅｉ
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅｐｒｅｓｅｎｔｓｔｕｄｙａｉｍｅｄｔｏｉｓｏｌａｔｅａｎｄｐｕｒｉｆｙｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ（ＴＰＳ）ｆｒｏｍｔａｒｏ（Ｃｏｌｏｃａｓｉａｃｈｅｍｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｗｉｔｈｈｏｔｗａｔｅｒ
ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）．Ｔｈｅ
ａｎｄｉｍｍｕｎｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｓｕｂｊｅｃｔｅｄ
ｔｏ
ｐｒｏｐｅｒｔｙｏｆｐｕｒｉｆｉｅｄｆｒａｃｔｉｏｎｓｗｅｒｅｅｘｐｌｏｒｅｄ．ＴｈｅｃｒｕｄｅＴＰＳＷａＳｅｘｔｒａｃｔｅｄ
ａｎｄ
ｔｈｅｎ
ｐｒｏｔｅｉｎｒｅｍｏｖａｌｂｙｔｈｅｅｎｚｙｍａｔｉｃ－ａｓｓｉｓｔｅｄＳｅｖａｇ
ｍｅｔｈｏｄ．ＴＰＳ
ｏｂｔａｉｎｅｄａｆｔｅｒｄｉａｌｙｓｉｓ
ａｎｄｆｒｅｅｚｅ・－ｄｒｙｉｎｇｕｎｄｅｒｗｅｎｔｆｕｒｔｈｅｒｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｂｙＤＥＡＥ－・５２
ａｎｄ
ＳｅｐｈａｄｅｘＧ・－７５ｃｏｌｕｍｎｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙａｎｄｔｈｒｅｅ
ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄ．ＴｈｅｐｕｒｉｔｙａｎｄｃｈｅｍｉｃａｌｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｗｅｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙＵＶｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙａｎｄＨＰＬＣ
ａｎｄ
ｂｙｇａｓ
ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＧＣ），ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＴｈｅｖｉａｂｉｌｉｔｙｏｆｍｏｕｓｅｓｐｌｅｅｎｃｅｉｌｓｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈＴＰＳｆｒａｃｔｉｏｎｗａｓ
ｗｅｒｅ
ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙＭＴｒａｓｓａｙａｎｄｔｈｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓａｎａｌｙｚｅｄｂｙｎｅｕｔｒａｌ
ｒｅｄ
ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓａｓｓａｙ．
Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓ
ｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＴＰＳｃｏｎｔａｉｎｅｄ９５．２１％ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ．ＴｈｒｅｅｆｒａｃｔｉｏｎｓＴＰＳｌｐ，ＴＰＳ２ｐｌ
ａｎｄ
ＴＰＳ３ｐ２ｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄａｆｔｅｒ
ｗｅｒｅ
ｓｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．ＤａｔａｆｒｏｍＵＶｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙａｎｄＨＰＬＣａｎａｌｙｓｉｓｒｅｖｅａｌｅｄｔｈａｔＴＰＳＩｐａｎｄＴＰＳ２ｐｌ
ｔｙｐｅｓｏｆｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｗｈｉｌｅＴＰＳ３０２
ｗｅｒｅ
ｔＷＯ
ｍｉｇｈｔ
ｂｅ
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ａ
ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ．ＡｌｌｔｈｅｔｈｒｅｅｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄｂｙＧＣａｎａｌｙｓｉｓ．ＴｈｅＭＴＴａｓｓａｙｓｓｈｏｗｅｄ
ｍａｄｅｏｆａｒａｂｉｎｏｓｅ，ｍａｎｎｏｓｅ，ｇｌｕｃｏｓｅａｎｄｇａｌａｃｔｏｓｅ
ｔｈａｔａｔｔｈｅｄｏｓｅｓｏｆ２５，５０Ｉ＿ｔｇ／ｍＬａｎｄ１００ｐｇ／ｍＬ，ＴＰＳｌｐｃｏｕｌｄｆｕｎｃｔｉｏｎｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃａｌｌｙｗｉｔｈＣｏｎＡｔｏｐｒｏｍｏｔｅｔｈｅｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆｓｐｌｅｅｎｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓｉｎｎｏｒｍａｌｍｉｃｅ，ｗｈｉｌｅｔｈｉｓｓｙｎｅｒｇｙｗａｓａｌｓｏｏｂｓｅｒｖｅｄｆｏｒＴＰＳ２。１ｏｎｌｙａｔ１００Ｉ＿ｔｇ／ｒｎＬａｎｄＴＰＳ３ｐ２ａｔ５０Ｉ＿ｔｇ／ｍＬａｎｄ１００ｃａｐａｃｉｔｙｏｆｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓｉｎ
Ｉｘｇ／ｍＬ．Ｍｅａｎｗｈｉｌｅ，ＴＰＳｌｐａｔ
ｍｉｃｅ．Ａｔ５０Ｈｇ／ｍＬ，ＴＰＳ２ｐｌａｎｄＴＰＳ３ｐ２
ｖａｒｙｉｎｇｄｏｓｅｓｃｏｕｌｄｍａｒｋｅｄｌｙｉｍｐｒｏｖｅｔｈｅｐｈａｇｏｃｙｔｏｔｉｃａｌｓｏｓｈｏｗｅｄｔｈｉｓａｃｔｉｖｉｔｙ．
ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｃｏｌｏｃａｓｌａａｎｔｉｑｕｏｒｕｍ；ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ；ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ；ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ｉｍｍｕｎｉｔｙｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ
中图分类号：Ｑ９４９．７１
ｄｏｉ：１０．７５０６／ｓｐｋｘｌ００２．６６３０－２０１３１９０５９
文献标志码：Ａ文章编号：１００２－６６３０（２０１３）１９－０２８７—０６
芋头别名为芋魁、土芝，俗称芋艿，属天南星科ｎ１。芋头中含有丰富的淀粉、膳食纤维、多糖、维生素和矿
收稿日期：２０１２—０９．１８基金项目：
物质元素，不仅可食用，还具有宽肠胃、补脾胃、腹中癖块、消痨散结等作用，主治肿毒、牛皮癣、烫火伤等
“十二五”国家科技支撑计划项目（２０ｌ１ＢＡＤ０２８０２）；安徽省科技攻关计划项目（１１０１０３０１０１２）
作者简介：姜绍通（１９５４一），男，教授，主要从事农产品生物化工研究。Ｅ—ｍａｌｌ：ｊｉａｎｇｓｈａｏｔｏｎｇ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃａ
万方数据
２８８
２０１３，Ｖ０１．３４，Ｎｏ．１９
良晶科学
※营养卫生
症口】。早期研究报道认为其主要功效与其含有花青苷、甾醇和过氧化氢酶等活性成分有关，特别是其中丰富的多糖可能具有重要作用，已有报道芋头中含有水溶性多糖，且富含杂聚糖ｐ】。多糖是自然界中储量丰富的生物聚合物，具有能量储存、结构支持、防御作用和抗原决定性等多方面的生物功能。而植物多糖具有特殊的生物活性，如协助消化、抗疲劳、抗病毒、抗菌消炎、抗衰老、抗辐射、抗肿瘤、降血糖、降血脂及免疫调节等Ｍ】。
目前国内关于芋头多糖的提取工艺和抗氧化活性具有初步的研究，有研究表明芋头中的一种中性多糖能够增强小鼠的体内免疫活性，也有报道表明芋头粗多糖具有良好的体外抗氧化性，但关于芋头多糖系统的分离纯化以及各组分的活性能力高低鲜有报道＂。８】。植物多糖的分离纯化方法多采用离子交换和凝胶柱层析相结合的方法，
而纤维素离子交换柱是一种常用的柱层析介质，本实验采用ＤＥＡＥ．５２离子纤维素交换层析柱禾］ＳｅｐｈａｄｅｘＧ一７５凝胶色谱柱层析相结合对芋头粗多糖（ＴＰＳ）进行分离纯化，并对其纯度、单糖组成和体外免疫细胞的调节功能等进行研究，比较各组分多糖对细胞免疫不同的调节能力，以期为芋头多糖的进一步研究进行探讨。
１
材料与方法
１．１
动物、材料与试剂
健康昆明种ＳＰＦ级雄性小鼠（体质量（２０＿２）ｇ，购于安
徽医科大学动物中心，合格证号为ＳＣＸＫ（皖）２０１１－００２）。
芋头购于合肥家乐福。
Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ
ＤＥＡＥ．５２纤维素、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ一７５葡聚糖凝
胶
美国Ｗｈａｔｍａｎ公司；刀豆球蛋ＥｔＡ（ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎＡ，
ＣｏｎＡ）、噻唑蓝（ＭＴＴ）美国Ｓｉｇｍａ公司；ＲＰＭＩ－１６４０完全培养液、台盼蓝染液
北京索莱宝科技有限公司；苯
酚、浓硫酸、无水乙醇、９５％乙醇、无水乙醚、丙酮、三氯甲烷、正丁醇、葡萄糖（均为分析纯）
国药集团化
学试剂有限公司。
１．２
仪器与设备
ＮＪＬ０７．３型实验用微波炉
南京杰全仪器有限
公司；Ｒ．２０１旋转蒸发器
上海申胜生物技术有限公
司；ＱＰ２０１０气相色谱．质谱联用仪
日本岛津公司；ＵＶ７５７ＣＲＴ紫外．可见分光光度计
上海成光仪器有限公司：Ａｇｉｌｅｎｔ
１
１００凝胶色谱仪美匡ＩＡｇｉｌｅｎｔ公司；Ｂｉｏ．
Ｒａｄ
Ｍｏｄｅｌ
６８０
ＣＯ，培养箱
美国Ｂｉｏ．Ｒａｄ仪器公司；ＨＣ．
３０１８Ｒ型高速冷冻离心机安徽中科中佳科学仪器有限
公司；ＢＳ一１００Ａ—ＬＣＤ自动部分收集器
上海琪特分析仪
器有限公司：ＭＣＯ．１７ＡＩＣ酶标仪
赛默飞世尔仪器公
司；超净工作台
上海新竹机电设备有限公司。
万方数据
１．３方法
１．３．１
芋头精制多糖（ＴＰＳ）的提取
新鲜芋头一清洗、去皮、切块一烘干质量至恒定一
粉碎过４０目筛一芋头干粉１００９－－＊Ｊ３［１Ａ．３０００ｍＬ蒸馏水微波预处理（４００Ｗ，８０ｓ）－－－８０。Ｃ水浴提取３ｈ一滤渣二次提取一合并滤液后浓缩一酶解去淀粉（先按照２０Ｕ／ｇ｝Ｊｌｌ入液化酶，７５℃，ｐＨ６．０酶解１。５ｈ，再按照２００ｕ／ｇ加入糖化酶，６０。Ｃ，ｐＨ６．５酶解１．５ｈ）一醇沉过夜一抽滤并用无水乙醇、无水乙醚、无水丙酮各淋洗２次一沉淀复溶一酶解脱蛋白（中性蛋白酶，ｐＨ６，６ｈ）－－＊Ｓｅｖａｇ法脱蛋白１３次一Ｈ２０２脱色素一流水透析３６ｈ（分子质量３５００Ｄ）一蒸馏水透析３６ｈ一浓缩后冷冻干燥一精制芋头多糖ＴＰＳ
１．３．２
ＴＰＳ含量的测定采用苯酚．硫酸法一］。
１．３．３
ＴＰＳ的ＤＥＡＥ．５２离子交换层析柱层析ｎ川
ＤＥＡＥ．５２阴离子交换柱（Ｃｌ～型）装柱（柱型：
１．６ｃｍ×８０ｃｍ），先用蒸馏水平衡２４ｈ，准确称取ｌｇ
ＴＰＳ
溶于最小体积的双蒸水中，６０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ后取上清液上柱。依次用双蒸水以及０．１～０．５ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＣＩ溶液、以２．０ｍＬ／ｍｉｎ的速率梯度洗脱，用自动部分收集器收集，以苯酚一硫酸法对ＴＰＳ的洗脱情况进行跟踪测试，检测多糖的含量。以试管的管号为横坐标，吸光度为纵坐标绘制洗脱曲线图。根据测定的结果合并多糖溶液，真空浓缩后对蒸馏水透析３６ｈ，冷冻干燥。主要组分中
包括一个中性多糖组分ＴＰＳ。（０．５７２９）和两个酸性多糖组分
１．３。４
ＴＰＳ主要组分的ＳｅｐｈａｄｅｘＧ一７５凝胶柱层析“”ＳｅｐｈａｄｅｘＧ一７５凝胶柱（柱型：１．６ｃｍ×６０ｃｍ）装柱后
用０．０２ｍｏＬ／Ｌ的ＮａＣＩ溶液平衡２４ｈ。上述３个组分ＴＰＳ．、Ｇ．７５凝胶柱，称取０．２９多ＮａＣｌ溶液中，上样
后用０．０２ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ来洗脱，洗脱速率为０．２ｍＬ／ｍｉｎ，用
自动部分收集器收集，每管收集２ｍＬ，苯酚．硫酸法跟踪检测糖含量，以管号为横坐标，吸光度为纵坐标绘制洗
脱曲线图，收集合并主多糖峰，透析脱盐、冷冻干燥。
得Ｎ３个主要的多糖组分ＴＰＳ。。（０．１６５９）、ＴＰＳ２ｐｌ（０．１０７９）和
１９９）。
１．３．５
ＴＰＳ中３个多糖组分的纯度鉴定
紫外光谱扫描Ｈ２１：将ＴＰＳｌｐ、ＴＰＳ２ｐｌ和ＴＰＳ３ｐ２配制成
ｌｍｇ／ｍＬ的溶液，以蒸馏水作为空白对照，紫外分光光度计在２００～４００ｎｍ范围内进行全波长扫描。
高效液相色谱法（ＨＰＬＣ）进行进一步的纯度鉴定，首先将样品配制成１０ｍｇ／ｍＬ的多糖溶液，过０．４５９Ｌ滤膜后
色谱条件：Ａｇｉｌｅｎｔｌ１００高效液相色谱系统，色谱
柱：ＴＳＫＧ３０００ＰＷ色谱柱，流动相：０．１ｍｏＬ／ＬＮａＣｌ，
ＴＰＳ２（０．１６５９）、ＴＰＳ３（０．１８７９）。
ＴＰＳ，和ＴＰＳ，分别再过Ｓｅｐｈａｄｅｘ糖组分小心溶于最小体积的０．０２ｍｏＶＬＴＰＳ３ｐ２（０．１进行ＨＰＬＣ分析“３１。
※营养卫生
匡墨蘧
ＴＰＳ
２０１３，Ｖ０１３４．Ｎｏ．１９
２８９
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ，柱温：３０℃，示差折光检测器温
度：３０℃。
１．３．６
１．３．６．１
贴壁的巨噬细胞中加入不同质量浓度的＇ｒＰＳ”ＴＰＳ，小
３ＰＪ和香菇多糖的ＲＰＭＩ一１６４０培养液（含血清）１００９Ｌ，
ＴＰＳ中３个组分的单糖组成分析多糖水解及糖腈乙酸酯衍生化”４。１５１
使多糖终质量浓度分别为２５、５０、１００９９／ｍＬ，同时设空白对照组（不含多糖的培养液１００ｐＬ），每组设６个复孔。将培养板置于饱和湿度，３７℃、５％ＣＯ，培养箱中培养２４ｈ后，弃去上清液，用３７℃的ＰＢＳ洗２次后加入０．０７２％中性红
ｌｏｏｒｔｕ孔，培养３０ｍｉｎ后弃去中性红，用ＰＢＳ洗３次，加入细
多糖的水解：分别取５ｍｇ多糖样品，溶解于４ｍＬ
２ｍｏｌ／Ｌ的ＴＦＡ中后封管，１２０℃水解４ｈ，浓缩至干再加入３ｍＬ甲醇继续蒸干，重复４４５次除尽残留的ＴＦＡ。将样品溶解于３ｍＬ蒸馏水中，ＤＩ］３０ｍｇＮａＢＨ。室温还原３ｈ，用２５％乙酸中和过量ＮａＢＨ。至溶液不再产生气泡，最后ＤＮ３ｍＬ甲醇继续蒸干４～５次除去副产物硼酸及水分。于
胞裂解液（坎０．１ｍｏＬ／Ｌ冰乙酸）：坎无水乙醇）＝１：１）２００ｒｔＬ／孔，４。Ｃ过夜，用酶标仪于波长５４０ｎｍ处测吸光度。吞噬能力以实验组吸光度与空白对照组吸光度的比值表示。
２
１２０℃烘箱中１５ｍｉｎ以充分除去水分，得到各样品的单糖
混合物，备用。
结果与分析
糖腈乙酰酯衍生物的制备：取上述的单糖混合物加
入３ｍＬ乙酸酐和３ｍＬＩＩＬＬ啶，密塞，１００℃反应ｌｈ，减压浓缩加３ｍＬ三氯甲烷溶解后用水萃取洗涤多次，最后用无
３
２．１
芋头多糖ＤＥＡＥ一５２离子交换柱层析结果
水ＮａＳＯ。去除残留水分，离心取上清液进行Ｇｃ分析。各标准品单糖无需水解处理，糖腈乙酰酯衍生物采用按上述方法制备。６种标准单糖分别为鼠李糖（Ｒｈａ）、阿拉伯糖（Ａｒａ）、木糖（Ｘｙｌ）、甘露糖（Ｍａｎ）、葡萄糖（Ｇｌｕ）、半乳
糖（Ｇａｌ）。
１．３．６．２
ｉ飞
２２
；１
１０Ｏ
气相色谱（ＧＣ）检测条件”６】
ｏ
２５５０７５１００１２５１５０
色谱柱：ＨＰ一５ｍＳ石英毛细柱（３０ｍ×０．３２ｍｍ，０．２５ｐｍ）；程序升温：色谱柱初温１５０℃，保留ｌｒａｉｎ，以１０℃／ｍｉｎ升温至２００℃，再以４℃／ｍｉｎ的升温速率升温
Ｆｉｇ．１
管号
图１
Ｅｌｕｔｉｏｎ
ＴＰＳ
ｅｌｌｒｖｅ
ＤＥＡＥ・５２离子交换柱洗脱曲线
ｏｎ
ｏｆＴＰＳ
ＤＥＡＥ・５２ａｎｉｏｎｅｘｃｈａｎｇｅｃｏｌｕｍｎ
至Ｕ２７０℃，保留ｌｍｉｎ；气化室温度：２８０℃；检测器温度３００℃；载气Ｈｅ流速２５ｍＬ／ｍｉｎ；Ｈ，流速４０ｍＬ／ｍｉｎ：空气
流速４００ｍＬ／ｍｉｎ；分流比１０：１；柱流速１．５ｍＬ／ｍｉｎ。
１．３．７
由图１可知，ＴＰＳ经过双蒸水和０Ｉｌｔ～０．５ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＣＩ
溶液梯度洗脱后分离得Ｎ６个洗脱峰，其中双蒸水洗脱组分的有一个最强的吸收峰，说明芋头多糖中主要为中性多糖。同时ＴＰＳ中还含有一部分的酸性多糖。由于
０．３～０．５ｍｏｌ／Ｌ
正常小鼠体外免疫细胞增值ＭＴＴ实验”７ｌ
取健康昆明种ＳＰＦ级雄性小鼠３只，按文献『１７］方法制得细胞浓度为３×１０６个／ｍＬ的脾单细胞悬液。９６孔板
中每孔加入细胞悬液１００９Ｌ，空白对照组每孔加入１００ｔａＬ
ＮａＣＩ溶液洗脱峰较小，考虑到后续葡聚糖
凝胶柱层析的可操作性，选取中性多糖组分ＴＰＳ．（２～１８管）和０．１、０．２ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ溶液分别洗脱的酸性多糖组分
含有ＣｏｎＡ和１０％标准胎牛血清的ＲＰＭＩ．１６４０完全培养液（ＣｏｎＡ的终质量浓度为５Ｉ＿ｔｇ／ｍＬ），实验组分别加入１００９Ｌ不同质量浓度的ＴＰＳｌｐ
ＴＭ
ＴＰＳ２（３０～４８管）；ｆＵＴＰＳ，（５６～７４管）作进一步的分离纯化。
收集这３个组分，透析脱盐后冷冻干燥，得蛰ＪＴＰＳ．、ＴＰＳ２、ＴＰＳ３３种白色的多糖粉末，其含量分别为５７．２０％、１６．５ｌ％和１８．７２％。
２．２
ＴＰＳ：。：、ＴＰＳ川、香菇多糖的
ＲＰＭＩ．１６４０完全培养液（含ＣｏｎＡ和血清），使得多糖的终质量浓度分别为２５、５０、１００９９／ｍＬ，每组设６个复孔在
饱和湿度、５％ＣＯ，、３７℃的培养箱中培养６８ｈ后，每孔加入５ｍｇ／ｍＬＭＴＴ５０９Ｌ，继续培养４ｈ后每孔再加入ｌｍＬ酸性异丙醇，混匀，使紫色结晶完全溶解。用酶标仪于５７０ｎｍ波长处测定吸光度。结果以彳啪。。值表示小鼠脾细胞能量代谢水平的高低。
１．３．８
ｚＰＳ中３个组分的ＳｅｐｈａｄｅｘＧ一７５凝胶柱层析结果
０ｏｌ
ｏ
晕
弋ｏ
０
小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红实验”８】按照文献【１８】的方法得到细胞数为１．５
Ｘ
１０６个／ｍＬ的
０
０
５
１０
１５
２０
２５
３０
３５
混悬细胞液。每孔１００Ｉ．ｔＬＮ入Ｎ９６孑Ｌ板中，放入３７℃、
管号
图２
Ｆｉｇ．２
５％ＣＯ：培养箱培养２ｈ，弃去上清液，再用３７。Ｃ的ＰＢＳ洗
去未贴壁的细胞，贴壁的细胞即为巨噬细胞。于每孔
ＴＰＳ。的ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－７５凝胶柱洗脱曲线
Ｏｎ
ＥｌｕｌｉａｎＣｌｌｌｗｅｏｆＴＰＳｌＳｅｐｈａｄｅｘ１７，－７５ａｎｉｏｎｅｘｃｈａｎｇｅ
ｃｏｌｕｍｎ
万方数据
２９０
２０１３，～ｒ０１．３４．Ｎｏ．１９
匡匿磕
※营养卫生
Ｏ．５０．４ｌ０．３飞
莩
０．２０．１Ｏ．０
０
５
１０
１５
２０
２５
３０３５４０４５
５０
５５
６０６５
管号
图３
ＴＰＳ２的ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－７５凝胶柱洗脱曲线
Ｆｉｇ．３
ＥｌｕｔｉｏｎＯｌｉＶｅｏｆＴＰＳ２０ｎＳｅｐｈａｄｅｘＧ－７５ａｎｉｏｎｅｘｃｈａｎｇｅｃｏｌｕｍｎ
０．５
０．４§０．３
莩
弋Ｏ．２
０．１
０．０
Ｏ
５
１０１５２０２５３０３５４０４５５０５５６０６５７０７５８０
管号
图４
ＴＰＳ３的ＳｅｐｈａｄｅｘＧ一７５凝胶柱洗脱曲线
Ｆｉｇ．４
ＥｌｕｌｉｏｎｃｕｒｖｅｏｆＴＰＳ３０ｎＳｅｐｈａｄｅｘＧ－７５ａｎｉｏｎｅｘｃｈａｎｇｅｃｏｌｕｎｍ
由图２可知，中性多糖ＴＰＳ．经过ＳｅｐｈａｄｅｘＧ．７５凝胶柱层析柱分离后得到一个单一的洗脱峰，说明ＴＰＳ．是单一
的多糖组分，收集７～２６管洗脱液，透析脱盐后冷冻干燥得到白色粉末状的中性多糖ＴＰＳ＂由图３可知，酸性多糖ＴＰＳ２经过凝胶柱层析分离后得至ＩＪＴＰＳ２ｐｌＳｔｌＴＰＳ２ｐ２两种组分，由于ＴＰＳ２０２较ＴＰＳ２ｐｌ含量较少，不便于后续的研究，收集主要组分ＴＰＳ捌（６～３２管）进行进一步的分析研究。
由图４可知，ＴＰＳ榴！过ＳｅｐｈａｄｅｘＧ一７５凝胶柱层析柱分离
后也得到两种组分ＴＰＳ３ｐｌ乘］ＴＰＳ３。２。而ＴＰｓ３ｐ２的含量远高ｊ：ＴＰＳ３ｐｌ的含量，为便于研究收集ＴＰＳ３ｐ２（３５～６１管）洗脱峰，对水透析脱盐后冷冻干燥。ＴＰＳ”ＴＰＳ２ｐｌ和ＴＰＳ３ｐ２的
含量分别为８２．５０％、６８．６３％、７１．５４％。
２．３
ＴＰＳ。。、ＴＰＳ２ｐｌ和ＴＰＳ３ｐ２的紫外光谱扫描和ＨＰＬＣ色
谱结果
由图５～７可知，ＴＰＳ．。、ＴＰＳ：。。和ＴＰＳ３Ｄ２分别进行
ＨＰＬＣ色谱分析，通过示差检测器检测，均呈现单一对称的尖峰，而这３个组分均是先经过阴离子树脂交换和分子排阻柱色谱分离后获得，故可认为ＴＰＳｌｐ、ＴＰＳ２ｐｌ和ＴＰＳ３Ｐ２为３种单一的多糖组分。在紫外光谱图中，可以看，Ｗ，ＴＰＳ。。和ＴＰＳ圳在波长２００ｎｍ左右有多糖的特征吸收峰，而在波长２６０ｎｍ和２８０ｎｍ处无明显特征吸收峰，说［珥ＴＰＳｌ。和ＴＰＳ：。，不含蛋白质、氨基酸和核酸，也不含酚类成分”９１，由图７可知，ＴＰＳ瑚除了有多糖的特征吸收峰以外，在波
长２８０ｎｍ处还有微弱的吸收峰，其中可能含有少量的蛋白质，而ＨＰＬＣ色谱显示ＴＰＳ３。２是单一纯品，故其可能是
一种含有少量的蛋白质的多糖蛋白复合物。
万方数据
１．４１．２１．０弋０．８
０．６０．４０．２
Ｏ．Ｏ
２００２２０２４０２６０２８０３００３２０３４０３６０３８０４００
波长／ｒｉｍ
１０８
＞６
暑４
２
０
２
４
６
８
ｌＯ
１２
１４
１６
１８
２０
时间／ｍｉｎ
图５ＴＰＳＩ。的紫外光谱扫描图和ＨＰＬＣ色谱图
Ｆｉｇ．５
ＵＶｓｐｅｃｔｒｕｍａｎｄＨＰＬＣｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｏｆＴＰＳＩｐ
２００２２０２４０２６０２８０３００３２０３４０３６０３８０４００
波长／ｒｉｍ
３．０２．５２．０＞１．５ｇ１．０
０．５０．０一Ｏ．５
２
４
６
８
ｌＯ
１２
１４
１６
１８
时间／ｍｉｎ
图６
ＴＰＳ２ｐｌ的紫外光谱扫描图和ＨＰＬＣ色谱图
Ｆｉｇ．６
ＵＶｓｐｅｃｔｒｕｍａｎｄＨＰＬＣｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｏｆＴＰＳ２ｐｌ
１．６１．４１．２１．０飞０．８
０．６０．４０．２
００
２００２２０２４０２６０２８０３００３２０３４０３６０３８０４００
波长／ｎｍ
※营养卫生
食品科学
２０１３，ＶｏＺ３４，Ｎｏ．１９
２９１
３．５３．０２．５２．０＞１．５ｇ
１０
０．５０．０—０．５
２
４
６
８
ｌＯ
１２
１４
１６
１８
时间／ｍｉｎ
图７
ＴＰＳⅫ的紫外光谱扫描图和ＨＰＬＣ色谱图
Ｆｉｇ．７
ＵＶ
ｓｐｅｃｔｍｍａｎｄＨＰＬＣｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｏｆＴＰＳ３ｐ２
２．４
ＴＰＳ”ＴＰＳ２。ｌ和ＴＰＳ３Ｄ２单糖组成分析
图８～１ｌ是混合标准品和ＴＰＳ”ＴＰＳ：。。和ＴＰＳ３Ｄ２的乙
酰衍生物的ＧＣ图谱，根据各单糖标准品的乙酰化衍生物的ＧＣ图谱，确定混合标准品在ＧＣ中的出峰顺序２～７分别为鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖，其中ｌ号峰是溶剂峰，未在图中标示。
９７８
ｆ
６
宝５
×４
善ｉ
１０—１
时间／ｍｉｎ
图８
标准单糖乙酰化衍生物ＧＣ图谱
Ｆｉｇ．８
ＧＣ
ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｏｆｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｔａｎｄａｒｃｂ
ｐ
ｏ一
×
＞
２３．
７８９１０
ｌｌ
１２１３１４１５１６
时间／ｒａｉｎ
图９
ＴＰＳｌ。乙酰化衍生物ＧＣ图谱Ｆｉｇ・９
ＧＣ
ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｏｆＴＰＳＩｐａｌｄｉｔｏｌａｃｅｔａｔｅ
１．７５１．５０
一１．２５
呈１００
己ｏ．７５薹０．５０
０．２５０．ＯＯ
７
８
９
１０
１１
１２
１３
１４
１５
１６
时间／ｍｉｎ
图ｌＯ
ＴＰＳｈｌ乙酰化衍生物ＧＣ图谱
Ｆｉｇ・１０
ＧＣ
ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｏｆＴＰＳ２ｐＩａｌｄｉｔｏｌａｃｅｔａｔｅ
万方数据
ｒ
ｏ一
×
一＞
ｉ
６７８９１０】１１２１３１４１５
１６１７
时间／ｍｉｎ
图１１
ＴＰＳⅥ乙酰化衍生物ＧＣ图谱
Ｆｉｇ．１１
ＧＣｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｏｆｏｆＴＰＳ３ｐ２
ａｌｄｉｔｏｌａｃｅｔａｔｅ
混合标准单糖的保留时间和峰面积见表ｌ，３种多糖
组分的保留时间和峰面积及各组分单糖种类和物质的量比结果见表２，ｎ－－Ｊ失［１ＴＰＳ”ＴＰＳ川币ＵＴＰＳ碰的单糖中均含有阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，ＴＰＳ。。中这４种单糖的物质的量比分别为２，７６：２．１２：７．６１：３．３０；ＴＰＳ２。。，ｐ４种单糖物质的量比为２．４４：４．０７：１．８７：１２．１０；ＴＰＳⅫ中４种单糖的物质的量比为１．２７：１．８９：１．１３：５．９７。而ＴＰｓ２。ｌ干ＨＴＰＳ瑚
中均有保留时间为１０．２４３ｍｉｎ的色谱峰，这可能是‘种未知单糖，尚待进一步研究。
表ｌ
标准单糖乙酰化衍生物的ＧＣ数据表
Ｔａｂｌｅｌ
ＧＣＤａｔａｏｆａｉｄｉｔｏｌａｃｅｔａｔｅｓｏｆｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｔａｎｄａｒｄｓ
标准单糖鼠李糖
阿拉伯糖
木糖
甘露糖
葡萄辖
、卜乳赣
保留时ｆｎｑ／ｍｉｎ８．９５３９．１３７９．４００１２，７３２１２．８９８１３．０４５峰向积
３３７５１１８
２９５４６３８
４９９１２８３
２４６５７７．８
２９０１７００
４１９５４６７
表２
ＴＰｓ。，、ＴＰＳ２ｐｌ和ＴＰＳ聊的单糖组分及单糖组成物质的量比
Ｔａｂｌｅ２
ＭｏｎｏｓａｃｅｈａｒｉｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｏｆＴＰＳｌｐ，ＴＰＳ２ｐＩａｎｄＴＰＳ３ｐ２
多糖组分保留时间／ｍｉｎ
峰而积
单糖组成
物质的擐比；
９１３０８１５１４．８…阿拉伯糖２．７６……
１２．７５８５２２５２．０”露糖
２１２１２．９３２２２０８２０．２葡萄糖
７．６ｌ１３．０７９１３８６３０．０半乳糖
３３０９．１２９７２１０９．８阿拉伯糖２．４４
１０．２４３１０２２３５２１２．７５６１００４１７．４甘露糖
４．０７１２．９２９５４１７６３葡萄糖
Ｉ８７１３．０８２５０７６６０．１半乳糖１２．１９．１３３
３７５３２．５阿拉们糖１．２７
１０．２４３７４０００５１２．７５８４６５０２．７甘露糖１．８９１２．９２８３２８２８．１葡萄糖１．１３１３．０８４
２５０６１９４
半乳糖
５．９７
注：・．多糖中各单糖的峰面积与标准单糖的峰面积的比值（实验时标准单糖质量和多糖样品质量相等）。
２．５
ＴＰＳ”ＴＰＳ２ｐｌ和ＴＰＳ３ｐ２小鼠体外脾细胞增殖ＭＴＴ实
验结果
淋巴细胞增殖实验是检测机体细胞免疫功能的‘种
体外实验，淋巴细胞在体外培养时，当受到非特异性刺
激物有丝分裂刺激后，可转化为淋巴母细胞从而使淋巴
细胞增殖。而ＣｏｎＡ是小鼠Ｔ细胞特异性丝裂原，测定多
糖协同ＣｏｎＡ促进小鼠淋巴细胞增殖的强弱，能反映多糖
对Ｔ淋巴细胞增殖功能的影响【２０１。３种多糖组分对ＣｏｎＡ促进的小鼠脾细胞增殖能力的影响结果见表３。
２９２
２０１３，Ｖ０１．３４，Ｎｏ．１９
食品科学
※营养卫生
表３
ＴＰＳ帕ＴＰＳ２Ｐ１和ＴＰｓ，ｐ２对ＣｏｎＡ诱导的小鼠脾细胞增殖
能力的影响伽－－６）
Ｔａｂｌｅ３Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆ
ＴＰＳｌｐ，ＴＰｓ却Ｉ
ａｎｄ
１１ＰＳ却２
ｏｎ
ｔｈｅＣｏｎＡ・ｉｎｄｕｃｅｄ
ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆ
ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ／ｎｖｉｔｒｏ加－－６）
组别ＴＰＳｌ。ＴＰＳ。．ＴＰＳｍ
香菇多糖
空白对照组０．４４６＋＿０．０７ｌ
０．４４６＿＋０．０７１
０．４４６＋０．０７ｌ０Ａ４６＿＋００７１刑量，
２５０．６１２－＋０．０６２＋０．４２６－＋０．０６３０．４８３－＋０．０５３
０．６２７±０．０５５＊
ｒｐｇ／ｍＬ）
５００．７９６±０．０８ｌ”０．４８７＋＿０．０７８
０．５９４±０．０６５＋Ｏ．８４９＋０．０９４＋＋
１００
０．８１６±０．０５９＊＊０．５６３－＋０．０４ｌ‘０．５８７±Ｏ，０８２‘
Ｏ，８０８－＋０．０６ｌ＋｝
注：＋．与空白对照组相比，有显著性差异（Ｐ＜Ｏ．０５）；＋＋．与空白对照组相比，有极显著性差异（Ｐ＜０．０１）。下同。
由表３可知，与空白对照组相比，３种质量浓度的ＴＰＳ，。和香菇多糖均可协同ＣｏｎＡ促进小鼠脾淋巴细胞的增殖，且高、中质量浓度的ＴＰｓ。。的协同能力更强（Ｐ＜０．０１）；只有高质量浓度的ＴＰｓ：。，对ＣｏｎＡ表现出较高的协同能力（Ｐ＜０．０５），而中、低质量浓度的ＴＰｓ：。。的协同能力并不明显，可能是因为质量浓度太低ＴＰＳ：。。对其作用不明显；高、中质量浓度的ＴＰｓ抛多糖协同ＣｏｎＡ能显著的提高小鼠脾细胞的增殖能力ｐ＜０．０５）。综上得出中性多糖ＴＰＳ。。可以很好的协同ＣｏｎＡ促进小鼠的脾淋巴细胞的增殖，促进Ｔ细胞的成熟分化，且其协同能力略低于香菇多糖。
２．６
ＴＰＳ＂ＴＰＳ，。，和ＴＰＳ瑚对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红实验结果
巨噬细胞是机体非特异性免疫系统的重要组成部
分，也是机体免疫监视功能的重要效应细胞，具有免疫监视、免疫防御和抗原呈递等免疫功能，对机体维持内部健康的环境起着至关重要的作用。而单核巨噬细胞的吞噬能力是衡量机体非特异性免疫功能的标志之一口”。３种多糖组分对小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力的影响结果见表４。
表４
ＴＰＳｌｐ、ＴＰＳ２Ｐｔ和ＴＰｓ３，２ｘ，／ｄ、鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力的影响铆硼
Ｔａｂｌｅ４
Ｅｆｆｅｃｔｓ
ｏｆＴＰＳｌｐ，ＴＰＳ砷ｔａｎｄ
ＴＰｓｋＯｎ
ｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ
ｉｎｄｅｘ（ｎ＝６）
Ｂｌ量／（ｐ．ｇ／ｍＬ）伸ｓ１２
ＴＰＳ圳ＴＰＳ塑
香菇多糖
２５１．１０９－＋０．１３４＊０．９７６－＋０．０９８
１．００５－＋０．０８８
０．９８９－＋０．１０７５０１．１８５－＋０．１４８＂＊１．１６５－＋０．０８９＊Ｉ．１４７±ａ１６８‘
１．１４１±ｏ．１５３’‘１００
１．１８２－＋０．１２４・＋
１．０４ｌ－＋０．１０３
１．１１９＋＿０．１４３’
１．１３９－＋０１４４＋＋
由表４可知，３种质量浓度ｆ簪ＪＴＰＳｌｐ均可显著提高小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力妒＜０。０５），中质量浓度ＩＥｌＴＰＳｚｐ，和高、中质量浓度的ＴＰＳ，讲香菇多糖能显著提高小鼠巨噬细胞的吞噬能力沪＜０．０５）。３种多糖组分对巨噬细胞吞噬能力的影响没有明显的剂量．效应关系，且可以看出ＴＰＳＩｐ表现出最高的活性能力，其余两种多糖组分也表现出一定的
活性能力。
３
结论
本实验以芋头为实验材料提取精制芋头多糖ＴＰＳ，通过ＤＥＡＥ．５２离子交换柱层和ＳｅｐｈａｄｅｘＧ一７５凝胶柱层析的分离纯化，｛！导至！ＪＴＰＳ】ｐ、ＴＰＳｌｐ、ＴＰＳ２ｐ２、ＴＰＳ３Ｐｌ和ＩＴＰＳ３ｐ２组分，对其中的３种主要组分ＴＰｓｌ。、ＴＰＳ２。－．；｝Ｉ］ＴＰＳ３ｐ２进行
万方数据
进一步研究，紫外扫描光谱和高效液相色谱分析结果表明这３种组分的均一度良好，ＴＰＳ，。和ＴＰＳ：。。是单一的多糖组分而ＴＰｓ瑚可能是一种多糖蛋白的复合物。单糖组成分析结果表Ｂ．，目ＴＰＳ∽ＴＰＳ：。。和ＴＰＳ３ｐ２中均由阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成，ＴＰＳ，。中这４种单糖的物质的量比分别为２．７６：２．１２：７．６１：３．３０；ＴＰＳ２。。中４种单糖物质的量比为２．４４：４．０７：１。８７：１２．１０；ＴＰＳ３Ｄ２中４种单糖的物质的量比为１．２７：１．８９：１．１３：５．９７。小鼠体外免疫实验结果
表明２５、５０、１００｝ｌ∥ｍＬ３种质量浓度＠ＴＰＳｌＤ’高质量浓
度ＴＰＳ２Ｄ】和高、中质量浓度的ＴＰｓ３ｐ２均可协同ＣｏｎＡ显著促进小鼠脾淋巴细胞的增殖能力；３种质量浓度ＴＰＳ＂中质量浓度的ＴＰｓ：。，和高、中质量浓度酐ＪＴＰＳｍ均可显著提高小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力。结果表明：ＴＰＳ”ＴＰＳ：。，和ＴＰＳ瑚对正常小鼠的细胞免疫功能均有一定的调节作用，而且ＴＰＳ，。较另外两种多糖表现出较高的活性能
力，在细胞免疫调节方面略低于香菇多糖，具有进一步
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芋头多糖的分离纯化及对细胞免疫的调节作用
作者：作者单位：刊名：英文刊名：年，卷(期)：
姜绍通， 汪洪普， 潘丽军， JIANG Shao-tong， WANG Hong-pu， PAN Li-jun
合肥工业大学农产品加工研究院,生物与食品工程学院,安徽省农产品精深加工重点实验室,安徽合肥230009食品科学Food Science2013,34(19)
本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_spkx201319059.aspx